利用柿子皮混菌发酵制备果醋及品质分析

田　璐，汪立平*

（上海海洋大学食品学院，上海水产品加工及贮藏工程技术研究中心，上海 201306）

利用柿子皮混菌发酵制备果醋及品质分析

田璐，汪立平*

（上海海洋大学食品学院，上海水产品加工及贮藏工程技术研究中心，上海 201306）

以柿子加工副产物柿子皮为主要原料，采用氧化葡萄糖酸杆菌、植物乳杆菌、明串珠菌发酵酿造果醋。通过单一菌种、多菌组合的发酵实验，以发酵时间和产品质量为指标，确定混合菌种发酵的最佳组合。采用顶空固相微萃取结合气相色谱-质谱联用技术鉴定了最佳醋品的挥发性香气成分，采用反相高效液相色谱法测定了主要有机酸含量。结果表明：当V（氧化葡萄糖酸杆菌）∶V（植物乳杆菌）=1∶1时，醋品品质最佳，发酵时间6 d，感官品评94.90 分，共鉴定出51 种挥发性香气成分，主要为醇类和酯类，有机酸中乳酸和乙酸为主要有机酸，柿香味和醋香浓郁、协调，口感佳，品质优。

柿子皮；混菌发酵；果醋；顶空固相微萃取/气相色谱-质谱法；反相高效液相色谱法

我国柿属植物资源丰富，分布范围广泛，据联合国粮食及农业组织统计，2011年我国柿树收获面积72万hm2（占世界90.13%），产量305万t（占世界76.05%）［1］。柿子除鲜食外，主要加工成柿饼等产品，在加工过程中会产生大量下脚料柿子皮，大部分被废弃处理，不仅浪费宝贵的资源，还污染环境。柿子皮占柿子总质量的10%～15%，其中富含膳食纤维、果胶物质和类胡萝卜素、叶黄素，可促进消化、改善肠道功能，还含有柿多酚，具有良好的总抗氧化活性、还原力、脂质过氧化抑制力、自由基清除能力以及抗动脉粥样硬化等功效［2-5］。果醋是以水果或果品加工下脚料为主要原料，利用现代生物技术酿制而成的一种营养丰富、风味优良的酸味调味品，兼有水果和食醋的营养保健功能，是集营养、保健、食疗等功能为一体的新型饮品［6］。果醋的加工通常采用两步式发酵，即酵母菌将糖类转化为酒精和醋酸菌发酵酒精生产醋酸［7］，近几年相关研究报道中柿子醋均以柿子全果为原料酿制而成。因此发酵柿子皮酿制果醋，不仅极大地保持了柿子皮本身的营养价值，并在一定程度上解决柿子皮浪费的现象，保护环境，达到变废为宝的目的。

传统发酵食品独特的风味及品质与其复杂的微生物群落关系密切，但在生产中普遍存在工业化程度低、产品品质不均及不良微生物污染等问题，制约了传统发酵食品的发展［8］。多菌种发酵不仅能在一定程度上提高原料利用率，缩短发酵周期，提高效率，还可以改善产品的营养品质。多菌种发酵在传统发酵食品中应用广泛［9］，近几年，混合菌种发酵苹果醋研究比较常见，且达到了预期的效果［10-11］，但应用于发酵柿子醋目前鲜见报道。

果醋品质评价中挥发性香气成分不仅是构成柿果醋风味物质的重要组成部分，而且是影响品质和典型性的重要因素之一，同时有机酸的含量及其各自独特的味道构成了果醋独特的酸味味感。近年来，顶空固相微萃取结合气相色谱-质谱（head-space solid phase micro-extraction/gas chromatography-mass spectrometry，HS-SPME/GC-MS）联用技术因操作简单、灵敏度高、无二次污染等优点广泛应用于椪柑［12］、山楂［13］、海棠果［14］、砂梨［15］、黑加仑［16］等果醋挥发性香气成分的分析中，提供了一定的理论基础。

本实验以柿子加工副产物柿子皮为主要原料，采用混合菌种发酵，确定最佳菌种组合，并测定最佳醋品的挥发性香气物质和有机酸含量，以期为柿果醋的香气特征研究提供科学依据，为柿果醋品质感官评价体系的建立和柿果醋产业发展提供参考，以获得发酵时间短、品质兼优的柿子皮醋。

1　材料与方法

1.1材料、试剂与菌种

柿子皮（广西甜柿） 广西省桂林恭城。

果胶酶（酶活力≥1 000 U/g） 烟台帝伯仕商贸有限公司；葡萄糖、结晶酚、亚硫酸氢钠、酒石酸钾钠、氢氧化钠、磷酸二氢钾、磷酸、甲醇等（均为分析纯）国药集团化学试剂有限公司；草酸、苹果酸、乳酸、乙酸、琥珀酸（均为色谱纯） 美国Sigma公司。

酿酒高活性干酵母（Saccharomyces cerevisiae）广西丹宝利酵母有限公司；氧化葡萄糖酸杆菌（Gluconobacter oxydans G-1，KT946836）、植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum LPPV-1，KT946838）、明串珠菌（Leuconostoc sp. LPV-1，KT946837）由上海海洋大学食品学院B208实验室从风味良好的自然发酵柿子醋中分离。

1.2仪器与设备

生化培养箱 上海博迅实业有限公司；PHS-3C型酸度计 上海精科仪器有限公司；手持糖度计 南京互川电子有限公司；H2050r低温冷冻离心机 湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；75PDMS/CAR萃取头、65PDMS/DVB萃取头 上海安谱实验科技股份有限公司；MSD 5977气相色谱-质谱联用仪 美国安捷伦公司；e2695高效液相色谱仪 沃特世科技公司。

1.3方法

1.3.1工艺流程

1.3.2操作要点

破碎榨汁：将柿子皮洗净剔除霉烂后，取1 kg用菜刀切碎成1～2 mm的小块，按m（柿子皮）∶V（无菌水）= 1∶2打浆，加入质量浓度为100 mg/L焦亚硫酸钾，以防果汁发生褐变。

酶法澄清：加入质量分数0.20%果胶酶于50 ℃酶解果浆60 min。

调整糖度：酶解后的含渣浆，用白砂糖将最终糖度调整至12%。

发酵剂的制备：活性干酵母加入3 g/100 mL的蔗糖溶液中，30 ℃培养1～2 h活化；氧化葡萄糖酸杆菌接种于醋酸菌液体培养基中，植物乳杆菌、明串珠菌分别接种于MRS培养基中，30 ℃培养10～12 h活化，离心收集菌体，用灭菌生理盐水洗涤3～5 次，平板计数发酵剂浓度为107～108CFU/mL，保存备用。

微生物发酵：分别将500 mL调配好的发酵液装入1 000 mL事先灭菌的锥形瓶中，加入0.02 g/100 mL酵母液，再按照不同的方式以体积分数1%接种量接入制备好的产酸发酵剂，8 层纱布密封，在30 ℃的恒温培养箱中进行发酵，每天用无菌枪头取样检测pH值和可溶性固形物含量（soluble solids content，SSC），两者不再下降时发酵结束，离心去废渣。单一菌种和多菌组合配比方式编号：1号（酿酒酵母）、2号（酿酒酵母+植物乳杆菌）、3号（酿酒酵母+明串珠菌）、4号（酿酒酵母+氧化葡萄糖酸杆菌）、5号（酿酒酵母+V（植物乳杆菌）∶V（氧化葡萄糖酸杆菌）= 1∶1）、6号（酿酒酵母+V（明串珠菌）∶V（氧化葡萄糖酸杆菌）=1∶1）、7号（酿酒酵母+V（植物乳杆菌）∶V（明串珠菌）∶V（氧化葡萄糖酸杆菌）=1∶1∶1）。

1.3.3产品品质评价

1.3.3.1感官指标

评委小组由20 位受过感官品尝培训的同学和老师按照表1项目对1～7号醋品认真品评、打分，取平均值作为感官评分结果。

表1　感官评分规则Table1　Criteria for sensory evaluation of fruit vinegar

1.3.3.2理化指标

总酸含量的测定 ：酸碱滴定法［17］；pH值的测定：pH计法；SSC：手持糖度计；还原糖含量的测定：3，5-二硝基水杨酸法［18］，标准曲线的回归方程为：y=1.380 3x-0.020 6（R2=0.997 1）。总多酚含量的测定：福林-肖卡法［19］，以没食子酸为对照品，得到的标准曲线回归方程为：y=0.000 9x+0.009 1（R2=0.997 5）。

1.3.3.3微生物指标

根据GB/T 2719 —2003 《食醋卫生标准》［20］规定，菌落总数≤104CFU/mL；大肠菌群数≤3 MPN/100 mL；致病菌（沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌）不得检出。

1.3.3.4香气成分HS-SPME/GC-MS分析

参考鲁周民等［21］的方法，略有改动。

样品处理：萃取温度60 ℃；插入GC仪进样口，于280 ℃解析10 min；色谱条件：HP-5MS毛细管色谱柱；程序升温40 ℃，保持5 min，以4 ℃/min升至110 ℃，保持5 min，再以5 ℃/min升至150 ℃，保持5 min，再以10 ℃/min升至210 ℃，进样口250 ℃。

1.3.3.5有机酸反相高效液相色谱（reversed-phase high performance liquid chromatography，RP-HPLC）分析

参考包蓉［22］的方法，略有改动。混合标准溶液的配制：配制草酸质量浓度为5、10、20、50、100 mg/L和质量浓度50、100、200、500、1 000 mg/L的苹果酸、乳酸、乙酸、琥珀酸的5 种混合标准品溶液；色谱条件：C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：体积分数3%甲醇-0.02 mol/L磷酸二氢钾（pH 2.6）；检测器波长：210 nm；流速：0.8 mL/min（1.5%甲醇、98.5%磷酸二氢钾）；柱温：25 ℃。

2　结果与分析

2.1柿子皮浆理化指标

将实验所用的广西甜柿皮加水打浆后测定各理化指标，结果如表2所示。

表2　柿子皮浆的理化指标Table2　Physicochemcial properties of persimmon peel pulp

由表2可知，柿子皮原浆糖度较低、酸度适中，调整糖度后发酵，能在一定程度上抑制其他杂菌的生长繁殖，提高醋品品质；总多酚含量偏高，使得醋品口感醇厚。因此，柿子皮是酿造果醋的理想原材料。

2.2混合菌种发酵最佳组合的确定

氧化葡萄糖酸杆菌、植物乳杆菌、明串珠菌是本课题组前期从香气浓郁、酸味协调的自然发酵柿子醋中筛选获得的。氧化葡萄糖酸杆菌不能把乙酸彻底氧化为二氧化碳和水，研究人员认为它是生产醋的真正起作用的菌种［23］；植物乳杆菌与人类的生活关系密切，是一种常见于奶油、肉类及许多蔬菜发酵制品中的乳酸菌，能通过胃并定殖于肠道发挥有益作用［24］，作用于苹果酸-乳酸发酵过程，引起有机酸的变化，使醋品的口感质量得以改善；明串珠菌一般应用于乳品加工中，代谢产物主要是双乙酰、醋酸和乙醇，这些化合物有利于产品风味的形成。本实验中采用酿酒酵母结合3 种产酸菌种单一发酵、两两组合发酵以及3 种组合发酵的方式，通过比较发酵时间和产品质量，试图探索出一种适合柿子醋发酵的混合菌种最佳组合。

2.2.1发酵时间的确定

发酵过程中每隔12 h取1 次样，测定发酵液中pH值和SSC的变化，如图1所示。随着发酵时间的推移，pH值和SSC均呈现下降的趋势，第1～4天下降比较明显，这可能是因为酵母利用发酵液中少量溶解的氧和充足的营养物质进行繁殖和代谢，生成大量的酒精，与此同时产酸发酵剂在空气中氧气的作用下将酒精氧化成酸，且pH值下降迅速也减少了发酵液感染杂菌的概率；第5～8天下降比较缓慢，可能是偏酸性的环境中抑制了酵母菌的代谢，整个过程中明显可以看出酒精发酵和醋酸发酵同时进行，与传统说法描述的两阶段完全分开存在差异。

图1　pH值和SSC随发酵时间变化情况Fig.1　Changes in pH and soluble solids content during vinegar fermentation

pH值和SSC均不再下降时，发酵结束，终点pH值不同，产酸速率不同。1～4号样品在第8天时发酵结束，单菌产酸速率为：植物乳杆菌＞氧化葡萄糖酸杆菌＞明串珠菌。5～7号样品在第6天时发酵结束，且终点pH值均低于单一菌种发酵终点pH值，5号样品的pH值下降最明显，且终点pH值最低为3.17，说明发酵过程中3 种产酸菌种之间起协同作用，其中植物乳杆菌与氧化葡萄糖酸杆菌的组合最好，混合菌种发酵可以缩短发酵时间，提高效率，增强酸度。

1号样品中只添加酵母没有添加产酸菌，pH值和SSC也呈现下降的趋势，这可能是原料本身和空气中存在产酸菌体，形成果醋；但对比2～7号接种产酸菌的样品，1号样品最终pH值高于其他样品，说明人工接种产酸菌可以使醋品酸度更高。所有样品在发酵过程中都没有使用摇床增加通气量进行好氧发酵，pH值仍能下降，说明本实验所用醋酸菌、乳酸菌为兼性厌氧菌，以后进行规模生产时不需要大量通入无菌空气，与传统的食醋好氧发酵制备法相比，本实验所用菌种更有成本优势。由于乙酸和乳酸都可能使样品pH值下降，为了验证样品的感官可接受性，有必要进行感官评定，并进一步进行HPLC分析样品的有机酸含量，了解其发酵产物组成。

2.2.2醋品感官品评及理化指标分析

表3　醋品理化指标分析及感官品评Table3　Physicochemcial indicators and sensory analysis of vinegar samples

由表3可知，不同方式发酵酿制的醋品在理化指标和感官品评上存在一定的差异，可能是因为不同菌种以及不同组合在利用柿子皮浆基质发酵时产酸以及产香的能力不同。醋品总酸的含量和pH值呈现负相关性，与SSC之间不存在相关性，可能是因为发酵结束后醋品中溶解的其他化合物含量不同造成的。酸味和甜味是影响果醋口感最主要的味道，两者相辅相成，恰当合适的范围和组合赋予醋品优质的口感，5号醋品发酵结束后总酸含量最高，颜色澄清透明有光泽，具有浓郁、协调的柿子香味和醋香，并伴随淡淡的乳香气味，口感柔和、酸甜适宜，感官评分为94.90 分。根据GB/T 30884—2014《苹果醋饮料》［25］，苹果醋中的总酸含量（以乙酸计）为≥3 g/kg，本实验中醋品总酸含量最低为12.14 g/kg，最高为17.17 g/kg，均高于国家标准，为之后醋品的陈酿以及勾兑提供了基础，建议以后制定柿子醋相关标准时可适当提高总酸的含量。

结合2.2.1节的发酵时间和2.2.2节的感官品评及理化指标分析，结果表明当V（植物乳杆菌）∶V（氧化葡萄糖酸杆）菌=1∶1发酵时，醋品品质最佳。1号醋品虽只添加酵母，但因发酵过程中原料本身和空气中产酸菌体的多样性及良好的共生性，形成了醋品独特的风味和口感，且与最佳醋品感官评分接近，但仅从感官评分的结果并不能有效体现出添加产酸发酵剂对醋品品质具体的影响，因此通过对比分析两者的香气成分和有机酸，更好地说明最佳混合菌种组合在酿造柿果醋方面的优势。

2.3最佳醋品挥发性香气成分分析

SPME是一种新型的样品前处理方法，结合顶空分析技术，建立适用于不同基质样品中挥发性和半挥发性物质的萃取分析。涂层是SPME萃取装置的核心，它的选择应根据分析物的极性、挥发性和分子质量等参数，不同的涂层对不同物质的吸附能力不同，因柿子醋的香气物质种类较多，因此采用75PDMS/CAR和65PDMS/DVB两种萃取头对醋品1号和最佳醋品5号中香气物质进行萃取，图2为使用65PDMS/DVB萃取5号醋品香气物质的总离子流色谱图。将两种萃取头结果合并，各类香气物质种类和相对含量结果分析见表4。

图2　5号醋品香气物质的总离子流色谱图Fig.2　Total ion current chromatogram of aroma components in the best vinegar product

表4　醋品的香气成分和相对含量Table4　Aroma components and their contents in vinegar samples

续表4

由表4可知，5号醋品中共检测出51 种香气物质，比1号醋品多6 种，其中相同的挥发性物质有23 种，但在两种醋品中相对含量存在差别。5号醋品中有28 种物质在1号醋品中未检出，1号醋品中有22 种物质在5号醋品中未检出，可能是因为发酵过程中不同微生物作用造成的。不同的香气成分的种类、数量、感觉阈值以及各自之间的相互协调作用使得两种醋品香气存在一定的差异。最佳醋品5号中香气物质的种类比鲁周民等［21］研究自然发酵柿果醋香气物质种类少且存在一定的差异，可能是因为柿子果实本身的风味物质含量比果皮多，且自然发酵条件下微生物群落关系复杂产生了多样的风味物质。

醇类化合物在两种醋品中的相对含量均最多，1号醋品为71.08%，高于5号醋品的64.48%，可能是醋酸发酵不完全的结果。其中乙醇相对含量最高，香气柔和、甜润，其次为苯乙醇，香味较独特，具有玫瑰香、茉莉香等多种愉快的花香和果香［26］。这些醇类物质提供给果醋圆润的口感，虽相对含量最高，但对香气品质的影响较酯类物质小。

酯类化合物被检出的种类最多，相对含量排第二，对果醋香味品质起到重要的作用，赋予各种果香的感官特性，是评价果醋品质的一个重要指标。5号醋品检出17 种，占总含量的32.20%，1号醋品检出14 种，占总含量的26.20%，其中含量最多的均为乙酸乙酯，乙酸乙酯具有强烈的果香和酯香，其次含量相对较高的乙酸苯乙酯带有玫瑰的蜜甜底香。这些酯类化合物构成了柿果醋独特的香气特征品质。

酸类化合物在果醋风味和品质方面对口感的影响较香气明显，适宜浓度的酸赋予果醋协调的醋香味。因醋品中乙醇的含量过高，使得SPME过程中萃取头对酸类化合物的萃取产生影响，因此后期进行了有机酸含量的测定。醋品中还含有少量的烷烃类、酮类和酚类化合物，对柿果醋香味呈现的影响还有待进一步研究。

2.4最佳醋品有机酸含量分析

2.4.1标准曲线绘制

图3　有机酸标准品的RP-HPLC图Fig.3　Chromatogram of organic acid standards

表5　5 种有机酸标准品的回归方程、相关系数和线性范围Table5　Linear equations， correlation coefficients， and linearity ranges for five organic acids

酸味是醋品最主要的感官特性之一，果醋中除乙酸外还含有苹果酸、乳酸等，有机酸除了部分延续果实中的有机酸外，还有部分来自发酵过程中生成新的有机酸。草酸广泛存在于植物源食品中，果实中谷氨酸的转化可形成琥珀酸。因此，本实验配制一系列不同质量浓度的草酸、苹果酸、乳酸、乙酸、琥珀酸有机酸标准品，按照1.3.3.5节的色谱条件进行分析，图3为有机酸标样的色谱图，得到有机酸线性回归方程及相关系数，结果见表5，相关系数均达到0.999以上，可用于检测与分析。

2.4.2有机酸成分含量分析

取醋品1号和最佳醋品5号进行色谱分析，测定其有机酸含量，结果见表6。

表6　醋品有机酸含量Table6　Organic acid contents in vinegar μg/mL

由表6可知，5号醋品和1号醋品有机酸的含量存在一定差异，5号醋品中含量最高的乳酸是1号醋品的3.5 倍，乙酸含量是1号醋品的2.2 倍，其他3 种有机酸含量差异较小，可能是因为5号醋品接入了产酸菌种造成的。5号醋品中乳酸含量占总酸的75%，乙酸含量占总酸的21%，是醋品中的主要有机酸，其次是苹果酸、草酸和琥珀酸。乙酸是果醋的主要酸味物质，醋香味强烈。植物乳杆菌的添加诱导了苹果酸-乳酸发酵过程，不仅把酸味尖刻的苹果酸转变成酸味较柔和的乳酸，还增加了醋品的风味多样性，使口味变得圆滑。同时含量较低的3 种有机酸也缓冲了乙酸的刺激性，琥珀酸鲜味比较突出，使醋品酸味柔和、醇厚，虽然含量很低，却是构成果醋的重要风味物质。5号醋品中乙酸含量为466.5 μg/mL，明显低于酸碱滴定法中总酸（以乙酸计）的含量，可能是因为酸碱滴定时存在其他有机酸的干扰，且所用的产酸菌种是自然筛选获得的，在发酵中易发生性能衰退及自然变异，对产乙酸有一定的影响，因此如何筛选和改良菌种以得到高性能的利于果醋生产的菌种有待进一步研究。

3　结 论

采用混合菌种发酵柿子加工下脚料柿子皮酿制果醋，当V（氧化葡萄糖酸杆菌）∶V（植物乳杆菌）=1∶1时，醋品品质最佳，共鉴定出51 种挥发性香气成分，有机酸中乳酸和乙酸为主要有机酸，成品醋色泽澄清透明，柿香味和醋香浓郁、协调，伴随淡淡的乳香气味，口感柔和、酸甜适宜。该方式混合菌种组合发酵不仅验证了柿子皮酿醋的可行性，在一定程度上解决了柿子皮浪费现象，而且缩短发酵时间、提高效率、改善醋品口感，为柿子皮醋的工业化生产提供了一定的参考。

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Mixed Culture Fermentation and Quality Analysis of Persimmon Peel Vinegar

TIAN Lu， WANG Liping*
（Shanghai Engineering Research Center of Aquatic-Product Processing and Preservation， College of Food Science and Technology，Shanghai Ocean University， Shanghai 201306， China）

The fermentation of fruit vinegar from persimmon peel， a byproduct of persimmon processing using Gluconobacter oxydans， Lactobacillus plantarum and Leuconostoc sp. was studied in this work. Fermentation experiments were carried out using single and mixed cultures. The optimal combination for mixed culture fermentation was determined based on fermentation period and product quality. The aroma components were identified by head-space solid phase micro-extraction combined with gas chromatography-mass spectrometry （HS-SPME-GC-MS） and the main organic acids were quantifi ed by reverse-phase high performance liquid chromatography （HPLC） in the best vinegar products. The results showed that a 1:1 （V/V） mixture of Gluconobacter oxydans and Lactobacillus plantarum gave the best product quality. The optimal vinegar fermentation time was 6 days. Under these optimized conditions， the sensory evaluation score was 94.9 points， and 51 aroma components， mainly alcohols， esters， with lactic acid and acetic acid being the predominant organic acids， were identifi ed in the product. Moreover， the product had a strong persimmon fl avor and a strong vinegar fragrance with a good balance between them and it tasted good.

persimmon peel； mixed culture fermentation； fruit vinegar； head-space solid phase micro-extraction combined with gas chromatography-mass spectrometry （HS-SPME-GC-MS）； reversed-phase high performance liquid chromatography （RP-HPLC）

10.7506/spkx1002-6630-201619033

TS261.9

A

1002-6630（2016）19-0197-07

田璐， 汪立平. 利用柿子皮混菌发酵制备果醋及品质分析［J］. 食品科学， 2016， 37（19）： 197-203. DOI：10.7506/spkx1002-6630-201619033. http：//www.spkx.net.cn

TIAN Lu， WANG Liping. Mixed culture fermentation and quality analysis of persimmon peel vinegar［J］. Food Science， 2016，37（19）： 197-203. （in Chinese with English abstract） DOI：10.7506/spkx1002-6630-201619033. http：//www.spkx.net.cn

2015-10-31

上海市科委工程中心建设项目（11DZ2280300）

田璐（1992—），女，硕士研究生，研究方向为食品发酵。E-mail：Lt20130517@163.com

汪立平（1968—），女，副教授，博士，研究方向为食品生物技术、食品发酵。E-mail：lpwang@shou.edu.cn