三正辛胺络合萃取法分离提取糖果中8种合成色素

欧阳丽，黎　瑛，章建辉，夏立新，胡丽俐，李　莎

(长沙市食品质量安全监督检测中心，湖南　长沙　410013)



三正辛胺络合萃取法分离提取糖果中8种合成色素

欧阳丽*，黎瑛，章建辉，夏立新，胡丽俐，李莎

(长沙市食品质量安全监督检测中心，湖南长沙410013)

以三正辛胺为络合剂，四氯化碳为稀释剂，采用络合萃取法对糖果中的柠檬黄、新红、苋菜红、胭脂红、日落黄、诱惑红、亮蓝和赤藓红8种合成色素进行了预处理研究。考察了样品溶液pH值、稀释剂种类、三正辛胺浓度、反萃相组成等对预处理效果的影响。结果表明，当样品溶液pH值为6.0，以四氯化碳为稀释剂，三正辛胺浓度为5%，无水乙醇-15%氨水(体积比1∶1)为反萃相时，8种合成色素的回收率为90%～98%。该预处理方法操作简单、快速、有机溶剂用量少、回收率高，适用于糖果中多种合成色素的分离提取。

三正辛胺；合成色素；络合萃取；高效液相色谱(HPLC)

人工合成色素因色泽鲜艳、着色力强、色调丰富、价格低而广泛用于食品生产加工业。但合成色素以苯、甲苯、萘等化工产品为主要原料，经一系列有机反应制成，甚至含有β-萘胺和α-氨基萘酚等致癌物，对人体具有一定的毒害作用[1-2]。我国现行国标中严格规定了糖果中合成色素的种类及最大使用量[3]。糖果富含甜味剂、转化糖、糖浆及辅料，基质复杂，因此，建立一种简便、准确的预处理方法分离提取其中的合成色素具有十分重要的现实意义。

目前，合成色素的分离提取方法主要有聚酰胺吸附法[4-6]、固相萃取法[7-8]、液-液分配法[9]。聚酰胺吸附法的吸附效果不理想，操作繁琐，常出现难抽滤的现象，且不适用于含赤藓红的样品；固相萃取法和液-液分配法操作费时，有机溶剂用量较大，不利于批量样品检测，且固相萃取法需配置固相萃取柱，分析成本较高。为解决这些难题，不断有新的预处理方法报道出来。其中，霍艳敏等[10]用甲醇-水代替水、乙醇-氨水作提取剂，有效地提取了冰淇淋中的10种合成色素；朱丽君等[11]采用无色素面粉作助沉淀剂，简化了聚酰胺吸附法的操作；郭京波等[12]将离子液体引入分散液-液微萃取测定食品中的柠檬黄与亮蓝，获得良好效果，但在多种合成色素同时检测方面尚存在不足。络合萃取法，又称为反应萃取法，是一种基于可逆反应的化学萃取方法。萃取时，通过选择适当的络合剂与目标溶质发生化学反应，形成不溶于水的络合物并将其从水溶液中提取出，以实现目标溶质与复杂基质的分离；反萃时，该络合物经过一定的处理即可实现络合剂再生以及溶质的同时回收。因此，络合萃取法具有操作条件温和、能耗低、高效、选择性高、环境友好等优点，自1987年被King教授[13]提出后，已广泛用于羧酸[14-15]、酚[16]、磺酸[17]等的分离提取及工业废水的处理过程[18-19]。目前络合萃取法用于分离提取合成色素的文献报道较少[9]，且已报道方法步骤繁琐、操作费时，不利于样品的批量处理。

本文以三正辛胺(TNOA)为络合剂、四氯化碳为稀释剂络合提取糖果中的8种合成色素，系统考察了样品溶液pH值、稀释剂的种类、三正辛胺浓度、反萃相组成等主要操作条件对分离提取效果的影响，旨在建立一种操作简单、有机溶剂用量少、回收率高的合成色素预处理方法，并结合高效液相色谱对其进行检测，以期为食品检测机构更好地监测糖果中的合成色素提供方法储备。

1　实验部分

1.1实验原理

萃取时，赤藓红分子上的酚羟基能与三正辛胺分子中的氮原子形成氢键，生成不溶于水的化合物，被萃取至有机相中；反萃时，该化合物遇碱则氢键断裂，赤藓红进入水相。

1.2仪器与试剂

Agilent 1260高效液相色谱仪(美国Agilent公司)，配自动进样器和二极管阵列检测器；CT14D型台式高速离心机(上海天美生化仪器设备工程有限公司)；SK-1型快速混匀器(江苏金坛医疗仪器厂)；A10型超纯水处理器(美国Millipore公司)；旋转蒸发仪(上海青浦沪西仪器厂)。

甲醇(迪马科技有限公司)、三氯甲烷(天津市化学试剂研究所)、四氯化碳(天津市化学试剂研究所)、氨水(天津市光复精细化工研究所)均为色谱纯；正丁醇(天津市光复精细化工研究所)、无水乙醇(天津市化学试剂研究所)、醋酸铵(国药集团化学试剂有限公司)、一水合柠檬酸(国药集团化学试剂有限公司)均为分析纯；苋菜红、日落黄、亮蓝、柠檬黄、胭脂红标准品购自中国计量科学研究院；新红、赤藓红、诱惑红标准品购自德国Dr.Ehrenstorfer公司；实验用水为超纯水。含合成色素的糖果与空白的糖果样品均购自当地超市。

1.3标准溶液的制备

精密称取各合成色素标准品，分别用水溶解定容，配制成浓度为0.5 mg/mL的标准储备液；准确移取各标准储备液适量，用水依次稀释成浓度为0.5，1.0，2.0，5.0，10.0，20.0 mg/L的混合标准工作溶液，现用现配。

1.4高效液相色谱条件

色谱柱：Agilent TC-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：A为0.02 mol/L醋酸铵溶液，B为甲醇，梯度洗脱程序：0～10 min，90%～80% A；10～15 min，80%～65% A；15～22 min，65%～2% A；22～25 min，2% A；25～27 min，2%～90% A；27～30 min，90% A 。流速：1.0 mL/min；PDA检测器扫描范围：190～800 nm；柱温：35 ℃；进样量：10 μL；检测波长：新红、苋菜红、胭脂红与诱惑红均为520 nm；柠檬黄430 nm；日落黄490 nm；亮蓝630 nm；赤藓红530 nm。

1.5样品处理

将糖果粉碎，混匀，准确称取5 g，加入约45 mL水，水浴加热超声溶解样品，冷却，5 000 r/min离心5 min，取上清液，用20%柠檬酸溶液调至pH 6.0，用水定容至50 mL；取25 mL上清液，加入含5%三正辛胺的四氯化碳5 mL，高速涡旋1 min，8 000 r/min离心5 min，分取有机相，重复提取1次，合并有机相；有机相中加入5 mL无水乙醇-15%氨水混合溶液(体积比1∶1)，涡旋10 s，8 000 r/min离心5 min，分取水相，重复提取1次，合并水相；水相于55 ℃旋转蒸发浓缩至约为4.5 mL，用20%柠檬酸溶液调至中性，用水定容至5 mL，经滤膜过滤，取10 μL滤液供HPLC测定。

1.6条件优化样品溶液的制备

用空白糖果代替含合成色素的糖果，按照5 g制备50 mL溶液的比例制备空白样品溶液，准确加入各合成色素标准储备液适量，使加标水平均为1.0 mg/L；分取适量，用20%柠檬酸溶液调至所需pH值，作为条件优化样品溶液使用。

2　结果与讨论

2.1样品溶液pH值对萃取率的影响

以三正辛胺为络合剂萃取溶液中的合成色素时，溶液pH值对萃取效果有重要影响。实验考察了不同pH值的样品溶液对合成色素萃取率的影响。结果显示，随着溶液pH值的升高，8种合成色素的萃取率先增加后降低。当pH<6.0时，可能是溶液中游离的H+与其中的盐形成了无机酸，而无机酸可与三正辛胺发生反应导致络合效果变差[20]。当pH>6.0时，溶液中的H+较少，不能将全部络合剂质子化，导致萃取率降低。因此，实验选择样品溶液的pH值为6.0。

2.2稀释剂种类对萃取率的影响

稀释剂在络合萃取时通过调节络合剂的粘度、密度、界面张力等物理性质来实现萃取过程的两相接触传质与萃取后的油水两相快速分离。考察了正丁醇、三氯甲烷、四氯化碳、十一醇作为稀释剂时，三正辛胺对合成色素的萃取率。结果表明：十一醇因粘度太大，乳化现象非常严重；正丁醇的乳化现象虽然较十一醇有改善，但不能实现油水两相快速分层；以三氯甲烷、四氯化碳作为稀释剂时，8种色素的萃取率高且有机相与水相分层快速。由于四氯化碳的极性比三氯甲烷弱，在水中的溶解度比三氯甲烷小，所以实验选择四氯化碳作为最佳稀释剂。

图1　TNOA浓度对萃取率的影响Fig.1　Effect of TNOA concentration on extraction efficiency diluent:tetrachloromethane;pH 6.0

2.3三正辛胺浓度对萃取率的影响

络合萃取时，络合剂的浓度在萃取过程中起着至关重要的作用。增大络合剂浓度，有利于络合反应向生成络合物的方向进行，萃取效率增高；然而，增大络合剂浓度会使有机相粘度增加，导致乳化现象严重。实验分别用不同浓度的三正辛胺-四氯化碳溶液对8种合成色素进行萃取，结果如图1所示。由图1可知，合成色素的萃取率随着三正辛胺浓度的增大而逐渐增大，当其浓度增至5%以上时，均能实现100%萃取。因此，实验选择三正辛胺的浓度为5%。

2.4反萃相组成对回收率的影响

合成色素从有机溶液返回至水溶液的过程称为反萃取；反萃取时的水溶液为反萃相；条件优化时，样品溶液中的合成色素经萃取、反萃取进入反萃相的量与原样品溶液中的量之比的百分数为回收率。考察了反萃相为2%的氨水以及不同比例的无水乙醇-2%氨水(1∶9，3∶7，1∶1，2∶1)时8种合成色素的回收率。结果表明，当反萃相为2%氨水时，合成色素几乎不能被反萃取，回收率很低，随着反萃相中无水乙醇比例的增加，8种合成色素的回收率逐渐增加，这是由于无水乙醇能与水、四氯化碳互溶，当反萃相中无水乙醇比例增加时，其作为分散剂能够增加水相与有机相的接触界面，增大合成色素的传质面积，有利于三正辛胺与合成色素形成的络合物和氨水溶液反应，促进反萃过程的进行。当无水乙醇-2%氨水的体积比为1∶1，继续增加无水乙醇比例，合成色素回收率增加的趋势不明显。因此实验选择无水乙醇-2%氨水的最佳体积比为1∶1。

实验进一步考察了氨水浓度对回收率的影响，结果显示，随着氨水浓度的增加，合成色素的回收率不断增大。这是由于反萃相中氨水浓度增加，导致游离的OH-浓度增加，有利于反萃过程的进行。当氨水浓度增至15%后，回收率随氨水浓度增加，其增加趋势不明显。因此，实验选择反萃相为无水乙醇-15%氨水(1∶1)。

2.5反萃相溶液酸度的调节

若反萃相溶液中乙醇含量大，则pH值高，不利于高效液相色谱分析，且高含量的乙醇会引起新红、柠檬黄、苋菜红的色谱峰形变差，定量不准确。实验采用水浴加热旋转蒸发的方式去除反萃相中的大部分乙醇。实验发现：如在旋转蒸发前先将反萃相的pH值调至中性，再浓缩至4.5 mL，旋转瓶瓶壁上会残留许多紫红色沉淀，赤藓红的回收率几乎为零。用2%氨水将沉淀溶解，经HPLC分析可知紫红色沉淀为赤藓红。若先将反萃相旋转浓缩至4.5 mL，再调其pH值至中性，则赤藓红不会在溶液中沉淀。

如果实验在温度较低的冬季进行，不宜用乙酸调节反萃相的pH值。因为温度低，乙酸凝固，不便取用，且乙酸浓度大，易使溶液中的合成色素因酸性太强而形成沉淀。因此，当反萃相被旋转蒸发浓缩至约4.5 mL时，本实验选用20%柠檬酸溶液调其pH值至中性。

2.6合成色素的回收率与富集因子

经过条件优化，确定最佳实验条件为：样品溶液的pH值为6.0，四氯化碳为稀释剂，三正辛胺浓度为5%，反萃相为无水乙醇-15%氨水(1∶1)，反萃溶液经55 ℃旋转蒸发浓缩后用20%柠檬酸溶液调pH值至中性，再定容。在最佳实验条件下，柠檬黄、新红、苋菜红、胭脂红、日落黄、诱惑红、亮蓝和赤藓红的回收率分别为92%，98%，95%，94%，96%，93%，95%，90%；富集因子(反萃相溶液与原始样品溶液中合成色素浓度的比值)分别为4.6，4.9，4.7，4.7，4.8，4.6，4.7，4.5。实验对原始样品溶液、萃取后的样品溶液和反萃相溶液用HPLC进行分析，结果如图2所示。由图2可见，图2B中8种合成色素的色谱峰在图2C中均未检出；图2B中8个色谱峰均在图2D中出现，且峰高约为B中对应峰峰高的5倍。结果表明：在最佳实验条件下，原始样品溶液中的合成色素全部被萃取，且几乎全部迁移至反萃相溶液中。

图2　合成色素的色谱图Fig.2　Chromatograms of the synthetic pigments A:eight synthetic pigments standard solution;B:the original working solution;C:the working solution after extracted;D:the strip solution after treated；1:tartrazine;2:new red;3:amaranth;4:ponceau 4R;5:sunset yellow;6:allura red;7:brilliant blue;8:erythrosine

2.7标准曲线与检出限

采用与标准物质色谱峰保留时间和PAD光谱图比较的方式进行定性分析；以峰面积(Y)为纵坐标，对应质量浓度(X，mg/L)为横坐标绘制定量工作曲线，得到线性回归方程，外标法定量。分别取浓度为0.5，1.0，2.0，5.0，10.0，20.0 mg/L的混合标准溶液进行测定，8种合成色素的质量浓度在0.5～20.0 mg/L范围内与其峰面积呈线性关系，线性回归方程、相关系数见表1。以3倍信噪比(S/N=3)计算检出限(LOD)，以S/N=10计算定量下限(LOQ)，结果见表1。8种合成色素的检出限为0.1～0.4 mg/kg，定量下限为0.3～1.2 mg/kg。

表1　8种合成色素的线性方程、相关系数、检出限与定量下限Table 1　Linear equations,correlation coefficients(r),LODs and LOQs of 8 synthetic pigments

2.8实际样品的测定

为验证本方法测定实际样品的可行性，选取4种具有代表性的含合成色素的糖果样品(分别为棒棒糖、彩虹糖、橡皮糖与棉花糖)进行加标回收实验，加标水平分别为2,4,20 mg/kg，每个水平平行测定3次，结果如表2所示。8种合成色素的回收率为80%～99%，相对标准偏差(RSD)为3.0%～5.5%，说明本方法回收率高，重现性好。

表2　糖果样品中8种合成色素的平均加标回收率与相对标准偏差Table 2　Average recoveries and RSDs of 8 synthetic pigments in candy samples

3　结　论

本文将络合萃取的原理引入糖果中合成色素的前处理，采用三正辛胺为络合剂、四氯化碳为稀释剂，通过条件优化，建立了一种操作简单、有机溶剂用量少、回收率高的合成色素预处理方法，并结合高效液相色谱对其进行分析检测。该方法的回收率高，能有效地分离提取糖果中的合成色素，且便于大批量样品的前处理，极大提高了实验效率，在实际检测中具有较高的应用价值。该法还可用于脂肪含量低的其它食品中合成色素的分析检测。

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Separation and Extraction of Eight Synthetic Pigments in Candy by Complexing Extraction with Tri-n-octylamineOU

YANG Li*,LI Ying,ZHANG Jian-hui,XIA Li-xin,HU Li-li,LI Sha

(Changsha Center of Supervision and Inspection on Food Quality Safety,Changsha410013,China)

Complexing extraction was applied in the pretreatment of eight synthetic pigments such as tartrazine,new red,amaranth,ponceau 4R,sunset yellow,allura red,brilliant blue and erythrosine in candy with tri-n-octylamine(TNOA) as complexing agent and tetrachloromethane as diluent.Effects of operation conditions such as pH of working solution,kind of diluent,TNOA concentration and the strip solution composition on pretreatment efficiency were investigated.Results showed that when pH value of working solution was 6.0,the diluent was tetrachloromethane,TNOA concentration was 5% and the strip solution was ethanol-15% ammonium solution(1∶1,by volume),the recoveries of eight synthetic pigments were in the range of 90%-98%.The results indicated that the method showed the advantages of simplicity,rapidness,low solvent consumption and high recovery,and was suitable for the separation and extraction of synthetic pigments in candy.

tri-n-octylamine(TNOA);synthetic pigment;complexing extraction;HPLC

2016-02-29；

2016-03-30

国家公益性行业科研专项项目(201310130)

欧阳丽，硕士，工程师，研究方向：食品质量安全分析，Tel：0731-88635360，E-mail：yangli8945@sina.com

10.3969/j.issn.1004-4957.2016.09.005

O657.72；TS264.4

A

1004-4957(2016)09-1105-06