磁固相萃取/气相色谱-串联质谱法测定花生中多种农药残留

朱建国，李培武，张　文，孙晓曼，杨青青，张　奇，张兆威，丁小霞

(中国农业科学院油料作物研究所，农业部油料作物生物学与遗传育种重点实验室，农业部生物毒素检测重点实验室，农业部油料产品质量安全风险评估实验室，农业部油料及制品质量监督检验测试中心，湖北　武汉　430062)



磁固相萃取/气相色谱-串联质谱法测定花生中多种农药残留

朱建国，李培武*，张文*，孙晓曼，杨青青，张奇，张兆威，丁小霞

(中国农业科学院油料作物研究所，农业部油料作物生物学与遗传育种重点实验室，农业部生物毒素检测重点实验室，农业部油料产品质量安全风险评估实验室，农业部油料及制品质量监督检验测试中心，湖北武汉430062)

采用溶剂热反应法一步合成制备出石墨烯基铁氧化物磁性材料(G-Fe3O4)，将其作为磁固相萃取吸附剂，通过优化样品提取液稀释比例、萃取材料用量、萃取时间、洗脱剂的种类和体积等条件，并结合气相色谱-串联质谱(GC-MS/MS)技术，建立了花生样品中9种常用农药多残留的检测方法。结果表明，该方法对9种农药的检出限为0.07～1.85 μg/kg，线性范围为0.23～1 000 μg/kg，相关系数(r2)均不低于0.994；在低、中、高3个不同加标水平下的平均回收率为81.9%～119.3%，相对标准偏差(RSD)为2.1%～6.6%。该方法简便易行、回收率高、稳定性好、成本低，为花生等高油脂复杂基质中农药多残留检测提供了一种快捷、高效、准确的分析方法。

磁固相萃取；气相色谱-串联质谱；农药残留；花生

花生是我国重要的油料作物和经济作物，也是我国具有优势的传统大宗出口农产品，在我国农产品出口贸易中占有重要地位[1]。由于花生在种植过程中极易受到多种病虫害的侵袭，需施用大量的农药加以防治，但不合理地使用及滥用农药，致使花生中农药残留超标的现象日益严峻，特别是百菌清、毒死蜱等常用杀菌剂和杀虫剂的严重超标，对人类的健康安全产生了威胁，也对我国花生的出口贸易造成严重影响[2]。由于农药种类繁多、结构复杂且易受样品基质干扰[3-5]，造成农药残留分析具有波动性和复杂性；而花生样品基质中高含量的油脂和蛋白不仅严重干扰了目标农药的有效分离，还会对仪器的分离、检测系统造成损伤[6]，给农药多残留分析造成更大的困难。因此，研究快捷、高效的样品前处理方法，有效消除基质干扰，是建立复杂样品基质中农药多残留分析技术的关键[7]。

目前用于高油脂样品分析的前处理方法主要有固相萃取、液液萃取、基质固相分散萃取和凝胶渗透色谱[8-9]等，这些方法的有机溶剂用量大、操作繁琐，或者需昂贵仪器，检测成本较高，不能满足现实检测的需求。

磁固相萃取是近几年发展起来的一种新型的样品前处理技术，通过外磁场作用即可实现磁性材料的快速分离，具有操作简单、传质迅速、材料可回收利用、环境友好的优点[10]，目前已广泛应用于农产品、环境中有机污染物的分析检测领域[11-13]。Heidari等[13]合成制备出碳包覆Fe3O4的磁性纳米复合粒子，利用磁固相萃取方法实现了对环境水样中痕量有机磷农药的有效富集；黄倩等[14]基于自制的苯乙烯-甲基丙烯酸共聚物改性的磁性微球，建立了果汁中5种有机磷农药的磁固相萃取/气相色谱检测方法，取得了良好的效果；但当前将磁固相萃取技术应用于花生等高油脂复杂基质中农药多残留分析的研究较少。

本文根据花生农残国标限量标准及近年来我国出口花生遭扣留的情况分析[15-16]，选择百菌清等花生中9种常见农药作为研究对象，将制备的石墨烯基铁氧化物磁性材料(G-Fe3O4)作为吸附萃取剂用于前处理净化过程，结合气相色谱-串联质谱(GC-MS/MS)技术，建立了花生样品中9种常用农药的磁固相萃取净化/GC-MS/MS检测方法，并成功应用于实际样品的检测。

1　实验部分

1.1试剂与仪器

单层氧化石墨烯粉末(0.5～5 μm,0.8～1.2 nm单层)：南京先丰纳米材料科技有限公司；乙二醇、无水三氯化铁粉末、无水乙酸钠、无水乙醇、乙腈、丙酮、正己烷、甲苯、甲醇(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)；百菌清、甲基对硫磷、杀螟硫磷、毒死蜱、三唑酮、甲基异柳磷、氟虫腈、腐霉利、异菌脲农药标准品(农业部环境保护科研监测所)：使用时以丙酮将9种农药标准品配成浓度为100 μg/mL的混合标准储备液，于4 ℃下避光保存备用；根据实验需要将混合标准储备液配制为梯度浓度的标准溶液系列和用于加标回收实验。

Milli-Q超纯水系统(美国Millipore公司);CPA224S电子分析天平(德国Sartorius公司)；微量移液器(德国Eppendorf公司)；AREC磁力搅拌器、涡旋振荡器(意大利VELP公司)；KQ-800KDE型高功率数控超声仪(昆山超声仪器有限公司)；水热反应釜(含聚四氟乙烯内胆，南京瑞尼克科技有限公司)；NDO-400定温恒温干燥箱(上海爱朗仪器有限公司)；Hitachi多用途离心机(日本日立公司)；真空冷冻干燥机(美国Thermo公司)；气相色谱-串联质谱仪(GC-MS/MS，日本岛津公司)；微型高速均质料理机(山东九阳股份有限公司)；螺口试剂瓶、研钵(上海垒固仪器有限公司)；强力磁铁(深圳盛誉磁业有限公司)；0.22 μm有机系滤膜(上海新亚净化器件厂)。

1.2石墨烯基铁氧化物磁性材料(G-Fe3O4)的制备

采用溶剂热反应法[17-18]，于水热反应釜中同时完成氧化石墨烯(GO)的还原和磁性Fe3O4晶体的形成[19]，一步法合成制备出石墨烯基铁氧化物磁性材料(G-Fe3O4)。具体操作步骤如下：准确称量400 mg单层GO粉末至100 mL螺口试剂瓶中(内含磁力搅拌子)，加入80 mL乙二醇，室温超声3 h，每0.5 h搅拌1次，直至GO粉末在乙二醇溶液中完全分散均匀。准确称量0.65 g无水三氯化铁粉末加入上述溶液中，室温超声30 min使其均匀分散后，在溶液中加入2.60 g无水乙酸钠，于磁力搅拌器上剧烈搅拌0.5 h，确保溶液体系均一。将混合溶液转移至水热反应釜的聚四氟乙烯内胆中，200 ℃下溶剂热还原反应8 h后，将反应釜冷却至室温，收集聚四氟乙烯内胆中的溶液至50 mL离心管中，8 000 r/min离心5 min，弃上层液体。向黑色沉淀物中加入适量无水乙醇，涡旋振荡使其充分分散，以洗涤未反应完全的残留试剂，8 000 r/min离心5 min，弃上层液体，重复洗涤步骤，直至上层液体澄清。将黑色沉淀物冷冻干燥3 h,用研钵将干燥后的黑色固体研细，即得G-Fe3O4。

1.3样品前处理

称取10.0 g待测样品于微型均质料理机的玻璃杯中，加入20 mL乙腈，高速均质3 min后，将匀浆液转移至50 mL离心管中，6 000 r/min离心5 min，收集上清液；下层沉淀物用20 mL乙腈涡旋振荡提取3 min后离心，合并两次提取上清液，待净化。

移取2.0 mL样品提取液于25 mL具塞玻璃试管中，用超纯水按体积比1∶7稀释混匀，加入10 mg G-Fe3O4，涡旋振荡萃取5 min，用强力磁铁将吸附目标物的G-Fe3O4材料吸引至试管侧壁，弃去样品溶液；加入5 mL 5%甲醇水溶液淋洗G-Fe3O4，涡旋振荡30 s后弃去淋洗液；加入4 mL甲苯-丙酮(1∶4)混合溶剂作为洗脱剂，涡旋振荡30 s，超声解吸附1 min后收集洗脱液，氮吹浓缩，然后用0.5 mL丙酮定容，过0.22 μm有机系滤膜；取滤液进行GC-MS/MS分析。

1.4GC-MS/MS条件

色谱柱：DB-5ms毛细管柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)；载气：高纯He气；柱流量：1 mL/min；PTV进样口温度：65 ℃；1 μL分流进样，分流比1∶20；溶剂延迟：6 min；色谱柱升温程序：初始温度40 ℃保持4 min，以25 ℃/min升至125 ℃；再以10 ℃/min升至300 ℃，保持4 min。离子源(EI)温度：250 ℃；电离电压：70 eV；检测器电压：0.2 kV；多反应监测(MRM)模式扫描。各目标分析物的保留时间、定量和定性离子对见表1。

表1　9种农药的保留时间、监测离子对和碰撞电压Table 1　Retention times,monitoring ion pairs and collision energies of 9 pesticides under MRM mode

图1　GO和G-Fe3O4磁性材料的红外光谱图Fig.1　FT-IR spectra of GO and G-Fe3O4

2　结果与讨论

2.1磁性材料的表征

2.2萃取条件的优化

以乙腈为提取溶剂，将空白花生样品按照“1.3”方法提取后，于样品提取液中添加9种目标农药的混合标准溶液至终浓度为200 μg/kg，利用G-Fe3O4磁性材料对样品提取液进行磁固相萃取净化。

图2　样品提取液稀释比例对9种农药萃取效率的影响(n=3)Fig.2　Effect of dilution ratio of sample extract on extraction efficiencies of 9 pesticides(n=3)

2.2.1样品提取液稀释比例进行磁固相萃取时，若萃取液中乙腈浓度过高，则易将材料富集的目标农药洗脱，导致其回收率降低，因此，样品提取液需用纯水进行适当稀释后才能进行磁固相萃取。前期实验中，移取2.0 mL添加目标农药混标的花生样品提取液若干组，用水分别进行1∶3，1∶5，1∶7和1∶9的稀释后，分别加入10 mg G-Fe3O4磁性材料涡旋萃取8 min，经5 mL 5%甲醇水溶液淋洗G-Fe3O4材料后，加入4 mL丙酮超声解吸附1 min，收集洗脱液氮吹浓缩至0.5 mL，过0.22 μm有机系滤膜并进行GC-MS/MS分析，实验重复3次，计算9种农药的回收率(如图2)。结果显示，样品提取液的稀释比例为1∶3和1∶5时，9种农药的回收率偏低；当稀释比例增至1∶7时，各目标农药的回收率达到最高；继续增大稀释比例至1∶9时，回收率不再增加，且萃取液中水的比例过高易造成体系中农药分散不均，影响目标农药的有效萃取。因此选择样品提取液的最佳稀释比为1∶7。

2.2.2萃取材料用量萃取材料用量是影响萃取效率的关键因素，固定样品提取液的稀释比例为1∶7，考察了不同G-Fe3O4磁性材料用量(3,5,10,15,20 mg)对萃取效率的影响，其他实验条件同“2.2.1”。通过实验进一步发现，洗脱剂用量为4 mL时，萃取材料用量过多易导致目标物洗脱不完全，为确保材料富集的目标农药能够全部回收，重复洗脱步骤1次，合并两次洗脱液进行检测，比较9种农药的回收率。结果显示，当磁性萃取材料用量从3 mg增至10 mg时，各农药的回收率明显增加，10 mg以后继续增加萃取材料用量，9种农药的回收率变化不大，说明10 mg的用量即可有效萃取9种农药，因此确定G-Fe3O4磁性材料的最佳用量为10 mg。

2.2.3萃取时间磁固相萃取是基于萃取溶液与萃取材料之间的质量传递，该过程是一个动态平衡过程[23]，萃取效率与萃取时间有着直接的关系。实验考察了萃取时间(1,2,3,5,8 min)对9种农药回收率的影响，其他实验条件按已优化的结果进行。结果显示，萃取时间在5 min以内时，随着萃取时间延长，9种农药的回收率逐渐增加；5 min以后，萃取过程基本达到平衡，回收率不再增加。为减少前处理时间，提高实验效率，选择萃取时间为5 min。

2.2.4洗脱剂的种类及体积 洗脱剂的种类和体积也是影响实验回收率的重要因素。实验中用甲醇、乙腈、正己烷、丙酮及甲苯-丙酮混合溶剂(1∶4) 5种洗脱剂来解吸附萃取材料富集的目标农药，其他实验条件按已优化结果进行。结果表明，以正己烷作为洗脱剂时，萃取材料表面因残留有微量水分，导致磁性材料在正己烷体系中结块沉积而无法均匀分散；使用其他4种洗脱剂时，萃取材料在洗脱液中分散性良好，其中丙酮和甲苯-丙酮混合溶剂(1∶4)对大多数农药的解吸附效果相近，且效果明显较优，而丙酮中添加适量甲苯后，百菌清等部分农药的回收率明显改善，这可能是由于甲苯与目标分析物在材料表面竞争吸附，促进了该类农药的解吸附[24]，此时9种农药均可获得满意的回收率。因此，最终选择甲苯-丙酮(1∶4)作为最佳洗脱剂。

进一步考察了洗脱剂的体积对解吸附效果的影响，分别用2,3,4,5 mL甲苯-丙酮(1∶4)混合溶剂进行解吸附，其他实验条件按已优化结果进行。结果表明，随着洗脱剂的体积增加，各农药的回收率逐渐升高；洗脱剂体积达4 mL以后，9种农药的回收率趋于稳定，说明4 mL甲苯-丙酮(1∶4)即可将萃取材料富集的目标农药洗脱完全。考虑到后续实验需进行氮吹浓缩，为提高实验效率，将洗脱剂的体积确定为4 mL。

2.3基质效应

气相色谱-质谱联用中的基质效应是指样品基质中的某些共提取组分进入进样衬管或者色谱柱后干扰待测物的分析过程，影响其质量或浓度测定的准确性[25]，主要表现为离子抑制或离子增强效应[26]。本实验采用空白花生样品提取液(按“1.3”条件处理)和丙酮，分别配制9种农药的基质标准溶液系列和溶剂标准溶液系列；采用标准曲线法，利用基质标准曲线和溶剂标准曲线斜率的比值(K)来评价基质效应的影响。结果显示，通过G-Fe3O4材料进行磁固相萃取净化处理后，基质标准曲线斜率与溶剂标准曲线斜率的比值为0.830～0.999(表2)，说明基质效应不显著，该方法可有效消除花生样品中高油脂复杂基质的干扰，适用于花生中农药多残留检测的前处理净化过程。

2.4线性范围与检出限

配制0.001～2 mg/kg浓度范围的9种农药混合的基质匹配标准溶液系列，按照“1.4”条件进行GC-MS/MS分析，9种农药标准溶液在MRM模式下的色谱图见图3。根据各目标农药的质量浓度(X,μg/kg)和对应色谱峰面积(Y)之间的关系进行线性回归分析；方法的检出限(LOD)和定量下限(LOQ)分别由信噪比(S/N)为3和10时对应的加标浓度确定。结果表明，该方法对9种农药的线性范围为0.23～1 000 μg/kg，相关系数(r2)均不低于0.994，LOD为0.07～1.85 μg/kg(表2)，远低于目前国内和国际规定的农药最大残留限量标准[15-16,27]。

表2　9种农药的基质效应、线性关系、检出限及定量下限Table 2　Matrix effects(K),regression relations，LODs and LOQs of 9 pesticides

　　

　　

　　图3　9种农药标准溶液的多反应监测(MRM)色谱图Fig.3　Chromatograms of 9 pesticides under MRM mode

2.5回收率与精密度

在空白花生样品中分别添加低、中、高3个浓度水平的农药混合标准溶液，按照最佳条件处理后进行GC-MS/MS分析，每个加标水平重复测定5次，计算各目标物的平均回收率与相对标准偏差(RSD)。结果显示，9种农药的平均回收率为81.9%～119.3%，RSD为2.1%～6.6%(见表3)，表明该方法具有较高的准确度和精密度，可以满足花生等复杂样品基质中多种农药残留的检测需求。

2.6实际样品检测

从武汉本地超市和农贸市场抽取20份花生样品，在最优条件下处理后进行GC-MS/MS分析。结果显示，6份花生样品中检出毒死蜱、杀螟硫磷和百菌清，其中毒死蜱的含量为0.032～0.139 mg/kg,杀螟硫磷的含量为0.022～0.093 mg/kg，仅有1份样品检出百菌清，含量为0.047 mg/kg。检出的上述3种农药均未超过国家规定的农药最大残留限量标准。

3　结　论

本文选择具有大比表面积和丰富官能团的石墨烯材料，将其进行磁修饰后，制备出兼具良好吸附性能和磁性的石墨烯基铁氧化物磁性材料(G-Fe3O4)；采用磁固相萃取法，并借助GC-MS/MS检测，建立了花生样品中9种农药的多残留分析方法。该方法操作步骤简单，有机溶剂消耗量少，材料可回收利用，且灵敏度高、准确度和精密度好，可满足花生等高油脂复杂基质中多种农药残留同步检测的需求。

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Determination of Pesticide Residues in Peanuts by Gas Chromatography-Tandem Mass Spectrometry Coupled with Magnetic Solid Phase Extraction

ZHU Jian-guo,LI Pei-wu*,ZHANG Wen*,SUN Xiao-man,YANG Qing-qing,ZHANG Qi,ZHANG Zhao-wei,DING Xiao-xia

(Oil Crops Research Institute of the Chinese Academy of Agricultural Science;Key Laboratory of Biology and Genetic Improvement of Oil Crops,Ministry of Agriculture;Key Laboratory of Detection for Mycotoxins,Ministry of Agriculture;Laboratory of Risk Assessment for Oilseeds Products,Ministry of Agriculture; Quality Inspectionand Test Center for Oilseeds Products,Ministry of Agriculture,Wuhan430062,China )

G-Fe3O4magnetic composite materials with excellent adsorption properties were successfully synthesized by solvothermal method,and then applied in magnetic solid phase extraction(MSPE) process for 9 common pesticides in peanut samples.The extraction conditions were optimized,such as dilution ratio of sample extract,amount of magnetic composite materials,extraction time,type and dosage of elution solvent.Coupled with gas chromatography-tandem mass spectrometry(GC-MS/MS),a novel multi-residue analytical method was established for these nine pesticides in complex peanut matrix.The results showed that the limits of detection for nine pesticides ranged from 0.07 μg/kg to 1.85 μg/kg,the linear ranges were 0.23-1 000 μg/kg,and the correlation coefficients(r2) were not less than 0.994.The average recoveries at three spiked levels ranged from 81.9% to 119.3%,with relative standard deviations(RSD) of 2.1%-6.6%.With the advantages of simple operation,high recovery,good stability and low cost,this method was a rapid,efficient and accurate technique for multi-residue determination of pesticide,especially in high fatty matrix such as peanut sample.

magnetic solid phase extraction(MSPE);gas chromatography tandem mass spectrometry(GC-MS/MS);pesticide residues;peanut

2016-02-29；

2016-04-20

国家自然科学基金(31471650)；公益性农业行业科研专项课题(201203037-05，201203094)；国家农产品质量安全风险评估重大项目(GJFP2016007)

李培武，研究员，研究方向：农产品质量与食物安全,Tel:027-86812943,E-mail:peiwuli@oilcrops.cn

张文，副研究员，研究方向：农产品质量与食物安全，Tel:027-86711839,E-mail:zhangwen@oilcrops.cn

10.3969/j.issn.1004-4957.2016.09.002

O657.63；F767.2

A

1004-4957(2016)09-1087-07