鼓槌石斛毛兰素诱导人结肠癌Caco-2细胞凋亡

崔名扬,康丹丹,和　磊,石玉洁,任建武,*

(1.北京林业大学生物科学技术学院,北京 100083;2.北京大学医学部药学院,北京 100191)



鼓槌石斛毛兰素诱导人结肠癌Caco-2细胞凋亡

崔名扬1,2,康丹丹1,和磊1,石玉洁2,任建武1,*

(1.北京林业大学生物科学技术学院,北京 100083;2.北京大学医学部药学院,北京 100191)

目的:研究毛兰素对人结肠癌Caco-2细胞增殖的抑制作用及其诱导细胞凋亡的分子机制。方法:采用 SRB法检测毛兰素对 Caco-2细胞增殖的抑制作用,用 Hoechst33342染色法观察细胞的形态学改变,流式细胞术检测细胞的凋亡率和细胞周期;蛋白免疫印迹法(Western Blot)检测细胞凋亡相关蛋白Caspase-3的表达水平。结果:与对照相比,毛兰素能抑制结肠癌细胞Caco-2的增殖,且抑制率随着药物浓度与时间增加,呈剂量时间效应,48 h半数抑制浓度IC50为0.845 μg/mL;毛兰素能诱导Caco-2细胞凋亡,并诱导细胞周期阻滞于G2期;Caspase-3活性裂解片段表达增高。结论:毛兰素对肿瘤细胞的增殖具有一定抑制作用且通过线粒体途径诱导Caco-2细胞凋亡。

毛兰素,结肠癌细胞Caco-2,细胞凋亡,鼓槌石斛

结直肠癌(Colorectal cancer,CRC)为人类高发恶性肿瘤,近20年来其发病率逐渐上升,对人类健康造成严重威胁[1]。结肠癌患者术后5年生存率较低且目前尚无治疗结肠癌的特效药,因此继续寻找高效的抗癌药物任重道远[2-3]。众多国内外学者尝试从天然药物中寻找能有效抑制癌细胞增殖,诱导其凋亡的药物用于结肠癌的治疗。

石斛属(Dendrobium)是兰科植物中一个较大的属[4],在我国分布有74种和2变种[5]。石斛属植物含多种化学成分,包括生物碱、酚类[6]、微量元素[7]等成分。其药理作用广泛,在抗肿瘤、提高人体免疫力等方面均有良好疗效[8]。鼓槌石斛(Dendrobium chrysotoxum Lindl)为兰科石斛属草本植物,产于我国西南部。毛兰素是从鼓槌石斛中分离得到的活性化合物之一,研究表明此类化合物具有良好的抗肿瘤活性,崔旭琴[1]等人研究证实了其对结肠癌细胞SW-480的生长抑制作用,毛兰素通过下调XIAP、Bcl-xL蛋白表达以及激活Caspase-9、7、3和PARP活性从而诱导SW480细胞凋亡。毛兰素对HL-60肿瘤细胞的生长、分化亦具有明显抑制作用,并且在镜下观察到细胞呈现凋亡形态学特征[9],毛兰素能通过调节Akt激酶活性、下调Mcl-1蛋白表达的方式诱导肝癌细胞Huh7凋亡[10],亦有研究表明毛兰素对胃癌细胞 SGC-7901生长分化具有明显抑制作用[11]。在国外已经有实验就毛兰素和以毛兰素为底物的衍生物ZJU-6的抗肿瘤效果进行比较[12],但毛兰素对结肠癌Caco-2细胞增殖的作用尚未有报道,因此本文探讨了鼓槌石斛毛兰素对Caco-2细胞的生长抑制作用及凋亡诱导作用,为深入开展石斛抗肿瘤活性物质基础及其分子机制研究提供参考,对于石斛属资源的合理开发利用具有重要意义。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

Caco-2人结肠腺癌细胞由北京大学医学部药学院张强老师惠赠;毛兰素纯度大于99.99%,浙江天皇药业有限公司;MEM培养液Gibco(C11095500BT);TCA(三氯醋酸)天津市永大化学试剂有限公司;SRB(磺酰罗丹明B)Sigma(1014409);JC-1、Hoechst 33342、Annexin V-FITC/PI双染法细胞凋亡检测试剂盒、RNA酶、PI(碘化丙啶)、Caspase-3活性检测试剂盒、Triton X-100(聚乙二醇辛基苯基醚)、Caspase-3、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(H+L)、辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG(H+L)碧云天生物试剂公司;BCA试剂盒南京建成生物科技有限公司;硝酸纤维素膜(NC膜)武汉博士德生物工程有限公司。

CO2细胞培养箱日本三洋公司;IM200-FL倒置荧光显微镜北京冠普佳科技有限公司;Multiskan Mks型酶标仪、Multifuge 1L-R高速冷冻离心机美国Thermo electron有限公司;TD25-WS台式多管低速离心机长沙平凡仪器仪表公司;DYY-7C电泳仪北京市六一仪器厂;转膜仪美国伯乐公司。

1.2实验方法

1.2.1细胞培养用含10%胎牛血清的MEM培养基(100 U/mL青霉素、100 mg/mL链霉素)于37 ℃、5% CO2条件下进行细胞培养,0.25%胰蛋白酶消化,传代。

1.2.2SRB法测定毛兰素对细胞的抑制率接种4×103个对数期的Caco-2细胞于96孔细胞培养板上,铺板24 h后分别加入不同浓度毛兰素(0.01875、0.0375、0.075、0.15、0.3、0.6、1.2 μg/mL)和1个空白组,3个时间点(24、48、72 h),至24、48、72 h药物处理时间点后弃去培养液,每孔加入200 μL 4 ℃(10%)TCA(三氯醋酸)固定细胞,4 ℃,固定1 h;固定结束后用去离子水冲洗5次,室温晾干,每孔加入100 μL SRB染液,染色30 min后弃去,用1%乙酸冲洗5次,室温干燥,用100 μL非缓冲Tris-base碱液(10 mmol/L,pH=10.5)溶解未与细胞蛋白结合的染料,水平摇床上振荡30 min,采用酶标仪在540 nm处测定其OD值并计算IC50,计算细胞抑制率:

抑制率(%)=((空白对照组OD值-实验组OD值)/(空白对照组OD值))×100

1.2.3观察细胞形态接种5×105个对数生长期的Caco-2细胞于12孔板中,铺板24 h后,加入不同浓度的毛兰素,设置0.6、1.2 μg/mL 2个浓度的毛兰素加药组和1个空白组,给药48 h后弃去培养液,用PBS洗2次,显微镜下观察,拍照(放大200倍)。

1.2.4共聚焦荧光显微镜观察线粒体膜电位接种5×105个对数生长期的Caco-2细胞于35 mm的共聚焦小皿上,铺板24 h后,加入不同浓度的毛兰素,设0.6、1.2 μg/mL 2个浓度和1个空白组,给药48 h后弃去培养液,用PBS洗2次,每次2 min,然后加入冷的4%多聚甲醛1 mL,室温固定15～20 min,之后用PBS洗2次,加入5 μg/mL的JC-1 37 ℃染色15 min,PBS洗2次,加500 μL PBS观察拍照检测。

1.2.5共聚焦荧光显微镜观察细胞核形态接种5×105个对数生长期的Caco-2细胞于35 mm的共聚焦小皿上,铺板24 h后,加入不同浓度的毛兰素,设0.6、1.2 μg/mL 2个浓度和1个空白组,给药48 h后弃去培养液,用PBS洗2次,每次2 min,然后加入冷的4%多聚甲醛1 mL,室温固定15～20 min,PBS洗两次,加入2 μg/mL的Hoechst 33342染色30 min,37 ℃,染色后PBS洗2次,加500 μL PBS上机检测。

1.2.6Annexin-V/PI法检测细胞凋亡在6孔细胞培养板上接种5×105个对数生长期的Caco-2细胞,铺板24 h后,分别加入不同浓度的毛兰素,设0.15、0.3、0.6、1.2 μg/mL 4个浓度和1个空白组,48 h后收集细胞,将细胞培养液吸出弃去,用1×PBS洗涤一次,胰酶消解贴壁细胞,1000 r/min离心5 min,弃上清。用预冷的PBS重悬细胞2次,加入400 μL×Binding Buffer轻轻重悬细胞。加入5 μL的Annexin V-FITC轻轻混匀,室温下避光孵育15 min。加入10 μL PI(碘化丙啶)染色液,混匀,避光染色5 min,1 h内上流式细胞仪检测。

1.2.7流式细胞术测定细胞周期分布接种1×106个对数生长期的Caco-2细胞于6孔细胞培养板上,铺板24 h后,加入不同浓度的毛兰素,设0.15、0.3、0.6、1.2 μg/mL 4个浓度和1个空白组,48 h后收集细胞,经75%冰乙醇-20 ℃过夜固定后,用PBS洗涤2次,加入RNA酶,终浓度为100 μg/mL,37 ℃酶解30 min,移入流式管,然后加300 μL PI(含0.1%的Triton X-100(聚乙二醇辛基苯基醚)),避光染色5 min,上机检测毛兰素对细胞周期分布的影响。

1.2.8Western Blot检测毛兰素对Caspase-3蛋白表达的影响采用PMSF裂解法提取药物处理后的细胞总蛋白[13]。简而言之,在50～80 μg总蛋白中加入适量4×SDS-PAGE上样缓冲液,并于95 ℃条件下变性5 min,5%～15% SDS-PAGE电泳分离后转移到NC膜上,经5%脱脂奶粉封闭后,用于抗Caspase-3一抗抗体孵育过夜以及辣根过氧化物酶(HRP)偶联的二抗抗体孵育,采用ECL法通过X-光片曝光显影从而检测Caspase-3蛋白表达,免疫印迹最后经洗涤后用β-actin作为内参确定蛋白上样量。

1.2.9统计学分析结果以均数±标准差表示,SPSS 13.0统计分析软件进行数据分析,p<0.05差异有显著性意义,p<0.01差异有非常显著性意义。

2　结果与分析

2. 1SRB法检测毛兰素对细胞抑制作用

图1所示表明,药物作用时间相同时,给药24 h后,随着毛兰素浓度的增加,毛兰素对Caco-2细胞的抑制率由6.67%上升至38.21%;给药48 h后,抑制率由16.5%上升至65.69%,并求得48 h IC50为0.845 μg/mL;给药72 h后,抑制率由22.38%上升至82.16%,表明毛兰素对Caco-2细胞的抑制率随着药物浓度的增加而升高。同样,当药物浓度相同时,随着作用时间的延长,毛兰素对Caco-2细胞的抑制率也呈现明显的升高趋势。表明毛兰素对细胞的增殖抑制作用具有剂量时间效应。

图1　毛兰素对Caco-2细胞的抑制作用Fig.1　The inhibition of erianin on Caco-2

2.2毛兰素对细胞形态的影响

如图2所示,显微镜可以看到对照组细胞密度大、细胞边缘光滑且贴壁性好。给药组细胞随给药浓度增大细胞生长缓滞,细胞数量比对照组少,连接消失、细胞间隙增大,皱缩成团,随着药物浓度增加漂浮细胞较多,死亡数量增加,并且细胞贴壁紧实程度下降出现细胞典型的凋亡形态特征。

图2　毛兰素对细胞形态影响(400×)Fig.2　The effect of erianin on cell morphology(400×)

2.3共聚焦荧光显微镜检测细胞膜电位水平

JC-1是一种碳氰化合物类阳离子荧光染料,可跨膜进入活细胞内定位于线粒体膜上,特异性地与线粒体内膜结合,只在细胞发生凋亡线粒体膜电位崩解时才释放出来,呈绿色荧光[14],见图3。由图3可知,对照组细胞呈明显的橙色,随着给药浓度增加,给药组细胞线粒体膜的绿色荧光信号逐渐增强,线粒体膜电位崩解,表明药物对细胞的凋亡诱导作用随给药浓度增大逐渐增强。

图3　毛兰素对线粒体膜电位的影响Fig.3　Impact of erianin on mitochondrial membrane potential

2.4毛兰素对细胞核形态的影响

细胞核形态变化如图4所示,经毛兰素处理48 h后,Caco-2细胞的生长增殖状态明显受到药物影响而产生抑制作用,由图中可以看出Caco-2细胞已经出现了凋亡细胞会产生的典型形态学特征变化,如细胞的体积减小,细胞质的密度增加以及细胞核固缩直至碎裂等状态,图中箭头指的是破裂的细胞核,随着药物浓度增加,可以看出破碎细胞核量增加。

图4　毛兰素对细胞核形态影响Fig.4　The effect of erianin on nuclear morphometry

2.5毛兰素对细胞凋亡率的影响

分别以不同浓度的毛兰素作用于Caco-2细胞,给药48 h后,观察药物作用后细胞凋亡率的变化与对照组比较(图5),毛兰素浓度为0.15、0.3、0.60、1.20 μg/mL时,总凋亡率分别为14.08%、29.26%、37.48%、53.02%,凋亡率依次增加,由表1可知,早期凋亡率和晚期凋亡率也随浓度增加而升高。

图5　毛兰素对细胞凋亡的影响Fig.5　Effect of erianin on apoptosis rate of Caco-2 cells注:Q1代表早期凋亡,Q2代表晚期凋亡。

毛兰素浓度(μg/mL)早期凋亡率(48h)晚期凋亡率(48h)03.94±0.641.31±0.230.157.06±0.745.7±0.96**0.312.8±1.04**16.7±1.73**0.613.84±2.04**22.1±1.71**1.223.7±2.47**29.4±1.58*

注:*p<0.05,**p<0.01,与0 μg/mL毛兰素空白对照组比较。

2.6毛兰素对细胞周期分布的影响

为探明毛兰素对细胞周期的影响,利用流式细胞仪分析Caco-2细胞在对照组以及0.15、0.3、0.60、1.20 μg/mL毛兰素处理后的细胞周期分布的状况。由图6可知,不同浓度的毛兰素处理Caco-2细胞48 h后,细胞周期被阻滞于G2期,随着毛兰素浓度的增加,可见G1期细胞比例下降以及G2期比例上升,表明毛兰素能诱导G2期阻滞从而抑制Caco-2细胞生长。

图6　毛兰素对细胞周期的影响Fig.6　Influences of erianin on on cell cycle

2.7Western Blot检测Caspase-3的表达

为进一步探明毛兰素诱导结肠癌细胞Caco-2凋亡的分子机制,用0(空白对照组)、0.6、1.2 μg/mL毛兰素处理Caco-2细胞并提取细胞总蛋白,通过Western Blot检测其对Caspase-3蛋白表达的影响。由图7可知,0.6、1.2 μg/mL毛兰素处理细胞后发现Caspase-3被剪切的17 ku小分子活性片段,表明Caspase-3被激活,而未加药组未见被剪切的17 ku小分子活性片段。正常情况下细胞中的Caspase-3无活性,以酶原(Procaspase-3)的形式存在,当细胞接受凋亡刺激时,它被系列反应激活被剪切为17 ku(Cleaved caspase-3)的活性小分子片段,进而诱导细胞发生凋亡[15-16],由结果可见药物处理细胞后caspase-3被剪切为17 ku的小分子片段,表明毛兰素可能是通过线粒体途径诱导细胞凋亡的,但其具体的分子调控机制则尚需近一步研究。

图7　毛兰素对caspase-3活性影响Fig.7　Effect of erianin on caspase-3 activity注:条带由左至右依次为0 μg/mL对照组、毛兰素浓度0.6、1.2 μg/mL。

3　讨论与结论

细胞凋亡又称细胞程序性死亡,是一个非常复杂的调控过程[1],近年来成为肿瘤治疗的研究热点,细胞在多种调控因子的共同作用下引起凋亡,在这个过程中细胞发生紧缩、膜上起泡、核染色质固缩于边缘、DNA片段化等。很多的抗肿瘤药物,例如化疗药物、激素都能够引起肿瘤细胞发生凋亡[17]。肿瘤细胞的死亡大部分是通过凋亡发生的,凋亡对肿瘤的抑制起到重要作用。研究表明,哺乳细胞中有三条信号通路导致凋亡的发生[18],分为内源信号通路、外源信号通路与内质网通路,内源信号通路是通过线粒体调控,因此也叫做线粒体通路。参与内源信号通路的蛋白包含Bcl-2家族蛋白、Caspase家族蛋白等[19],其中Caspase-3是线粒体通路重要的执行蛋白,是调控细胞凋亡的重要因子,Caspase-3被剪切活化后大致通过以下3种机制诱导细胞凋亡[20]:酶解凋亡抑制物,如Bcl-2蛋白家族中的抗凋亡蛋白Bcl-2等；酶解细胞外基质,如细胞周期素依赖性激酶抑制因P21等；剪切失活DNA修复因子,如PARP(多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶)。在细胞受到药物刺激后线粒体跨膜电位崩解、线粒体基质内渗透压升高、内膜肿胀[21],诱使位于线粒体膜间隙的细胞色素C释放到胞浆中,而释放到胞浆中的细胞色素C结合凋亡蛋白酶活化因子Apaf-1形成复合体,激活Caspase连级反应激活下游的Caspase-3,从而诱导细胞凋亡[22-24],实验中经毛兰素处理的细胞中检测到Caspase-3被剪切激活的17 ku(Cleaved caspase-3)小分子片段,同时也检测到细胞线粒体膜电位的改变,表明毛兰素可能是通过影响线粒体功能,引起线粒体跨膜电位改变激活caspase-3活性进而诱导细胞凋亡的。

综上所述,本研究证明毛兰素在一定程度上能抑制Caco-2细胞的增殖,呈时间剂量效应,能诱导Caco-2细胞凋亡,诱导胞内线粒体膜电位的改变及诱导细胞周期阻滞于G2期,同时Western Blot检测到Caspase-3被激活活性片段,表明毛兰素可能是通过线粒体途径诱导细胞凋亡的,但其诱导细胞凋亡是否有其他通路的参与尚需进一步实验证明,同时毛兰素化学结构与抗癌活性之间的相互关系尚需深入研究。

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Erianin induces apoptosis of human colorectal cancer Caco-2 cells

CUI Ming-yang1,2,KANG Dan-dan1,HE Lei1,SHI Yu-jie2,REN Jian-wu1,*

(1.Beijing Forestry University,College of Biological Sciences and Biotechnology,Beijing 100083,China;2. Peking University Health Science Center,School of Pharmaceutical Science,Beijing 100191,China)

Objective:Growth inhibition effects of erianin on human colorectal cell line Caco-2 cells and its possible mechanism were studied. Methods:SRB assay was employed to evaluate the anti-proliferation effect of erianin on Caco-2 cells.The morphological changes of treated Caco-2 cells were observed with 33342 staining.Cell cycle distribution and the proportion of apoptotic cells were evaluated using flow cytometry. Western Blotting analysis was used to detect the expressions of apoptosis related protein Caspase-3. Results:Erianin inhibited proliferation of Caco-2 cells in a dose-and time-dependent manner and leaded to cell apoptosis.The IC50value was 0.845 μg/mL after 48 h exposure to erianin. Cell cycle was arrested in G2phase. It was also observed that the expression of activity fragmentation of Caspase-3 showed a significant increase. Conclusion:Erianin could inhibit the proliferation of Caco-2 cells and the apoptosis of Caco-2 cells induced by erianin may be associated with mitochondrial pathway.

erianin;Caco-2;apoptosis;DendrobiumchrysotoxumLindl

2016-03-04

崔名扬(1995-)，女，大学本科，研究方向: 天然产物研究与开发，E-mail：18701590313@163.com。

任建武(1967-)，男，副教授，研究方向: 天然产物研究与开发，E-mail：jianwur@sina.com。

国家自然科学基金项目(31572149)；国家级大学生创新创业训练计划(201510022029)。

TS201.3

A

1002-0306(2016)16-0352-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.16.062