酸浆五种部位醇提物的活性比较研究

丁　盼,刘金娟,周小琪,薛羚伟,孙　勇,蒋继宏

(江苏师范大学生命科学学院,江苏省药用植物生物技术重点实验室,江苏徐州 221116)



酸浆五种部位醇提物的活性比较研究

丁盼,刘金娟,周小琪,薛羚伟,孙勇,蒋继宏*

(江苏师范大学生命科学学院,江苏省药用植物生物技术重点实验室,江苏徐州 221116)

目的:探讨酸浆根、茎、叶、宿萼和浆果醇提物的抑菌、抗氧化、抗肿瘤和抑炎活性。方法:采用牛津杯法检测酸浆五种部位醇提物对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的抑菌活性;DPPH清除法检测其抗氧化活性;Alamar Blue法检测其对人乳腺癌细胞株MCF-7、MDA-MB-231和肝癌细胞株Bel7402的抑制效果;一氧化氮检测试剂盒测定其抗炎活性。结果:浆果对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌效果最好,叶对枯草芽胞杆菌抑菌活性较明显,抑菌圈分别为(16.63±0.49)、(14.97±0.37)、(15.83±0.29) mm。宿萼的抗氧化活性最高,浓度为5 mg/mL时对DPPH的清除率为96.79%±2.09%,基本和同剂量的VC效果相当。酸浆各部位醇提物对肿瘤细胞的抑制作用呈现浓度依赖性,其中根对MCF-7的抑制活性较强,宿萼对MDA-MB-231和Bel7402的活性较强,IC50分别为(31.46±1.49)、(48.84±1.69)、(65.48±1.82) μg/mL。叶的抗炎效果最佳,茎抗炎效果较弱,10 μg/mL时NO产生量分别为11.01、27.73 μmol/L。结论:酸浆具有一定的抑菌、抗氧化、抗肿瘤和抗炎活性,为酸浆的功能开发及活性成分分离提供一定的理论依据。

酸浆,抑菌活性,抗氧化活性,抗肿瘤活性,抗炎活性

酸浆(PhysalisalkekengiL.)又名红菇娘、挂金灯等,为茄科(Solanaceae)酸浆属(Physalis)多年生草本植物。其适应性很强,耐寒、耐热,喜凉爽湿润气候,遍布大江南北,东北地区产品质量较好。因其具有清热、解毒、利尿、降压、强心、抑菌等作用,可药食两用[1],备受广大研究者的关注。

酸浆中主要含有苦素类、皂苷类和黄酮类等生物活性物质[2-5],具有广泛的生物学功能。Li X[6]等发现酸浆苦素对大肠杆菌具有较强的抑制作用。Laczko-ZoldE[7]等利用DPPH法探究酸浆的干果和湿果抗氧化活性差别较大。He Hao、Wu SJ[8-9]等分别研究了酸浆苦素A和酸浆提取物诱导肿瘤细胞的凋亡作用。Ji L等[10]和Kwak CS[11]探讨酸浆提取物对促炎因子等产生的影响,发现具有明显的抗炎作用。酸浆以浆果供食用,然而其非可食部位(根、茎、叶和宿萼)利用率相对较低,有关酸浆不同部位的活性比较尚未见报道。本研究以酸浆根、茎、叶、宿萼和浆果为研究对象,比较其醇提物的抑菌、抗氧化、体外抗肿瘤和抗炎活性,筛选出其主要活性部位,为酸浆的进一步基础研究与功能开发提供理论基础和科学依据。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

酸浆采自东北黑龙江,经专业人士鉴定为茄科酸浆属酸浆(PhysalisalkekengiL.);金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、大肠杆菌(Escherichiacoli)和枯草芽胞杆菌(Bacillussubtilis)购自徐州防疫站;人乳腺癌细胞株MCF-7、MDA-MB-231、肝癌细胞株Bel7402和小鼠单核巨噬细胞RAW264.7购自上海中科院细胞库;Alamar Blue美国Sigma公司;青霉素、链霉素和胰蛋白酶等南京生兴生物技术有限公司;胎牛血清北京全式金生物技术有限公司;DMEM和RPMI 1640培养基美国Gibco公司;一氧化氮检测试剂盒碧云天生物技术研究所;DMSO及其余试剂为国产分析纯。

KQ-500TDE高频数控超声清洗器昆山市超声仪器有限公司;RE-52A旋转蒸发仪上海亚容生化仪器厂;Forma Series II二氧化碳细胞培养箱美国Thermo公司;96孔细胞培养板美国Gibco公司;Synergy2多功能酶标仪美国BioTek。

1.2实验方法

1.2.1酸浆各部位醇提物制备挑选无虫蚀、果实成熟的酸浆全株,根、茎、叶、宿萼和浆果经干燥粉碎后,分别准确称取48 g,置于500 mL锥形瓶中。加入95%乙醇,超声提取30 min,4000 r/min离心20 min,取出上清液。重复3次,合并上清液后减压浓缩得干燥浸膏分别为2.4、2.7、3.6、3.2、4.1 g,密闭冷藏,备用[12-13]。

1.2.2抑制病原细菌实验采用牛津杯法[14],每平板倒入20 mL的LB培养基,凝固后,用移液枪取金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和枯草芽胞杆菌的菌液各200 μL均匀涂布于培养基上,涂布后以平板无可见水滴为准。将根、茎、叶、宿萼和浆果醇提物用丙酮制成40 mg/mL的受测液,分别加入牛津杯中。每个平板中放2个牛津杯,各加入同一药液200 μL,同时以200 μL的丙酮作为阴性对照,200 μL的1 mg/mL青霉素作为阳性对照,每组设3个重复。将平板置于37 ℃恒温培养箱中培养24 h。观察有无抑菌作用,游标卡尺测量抑菌圈大小,比较抑菌效果[15]。实验重复3次。

1.2.3抗氧化活性实验DPPH自由基清除法是一种重要的检测天然植物提取物或化合物抗氧化活性的方法,其结构简单、性质稳定、反应容易控制,是未来抗氧化剂自由基清除活性筛选的首选方法[16]。本实验采用DPPH法将根、茎、叶、宿萼和浆果的醇提取物用50%乙醇配成8、40、200、1000、5000 μg/mL不同浓度的受测液备用,每个浓度设3个复孔,517 nm处测各孔的吸光度。100 μL DPPH溶液+100 μL受测液吸光度(A0),100 μL DPPH溶液+100 μL 50%乙醇溶液的吸光度(A1),100 μL受测液+100 μL 50%乙醇溶液的吸光度(A2)。选用抗坏血酸(VC)作为阳性对照。按式(1)计算DPPH自由基清除率。实验重复3次。

式(1)

1.2.4细胞培养与体外抗肿瘤细胞活性实验采用Alamar Blue法检测酸浆醇提物体外抗肿瘤细胞活性[17]。人乳腺癌细胞株MCF-7、MDA-MB-231和肝癌细胞株Bel7402用含10%胎牛血清的培养液于37 ℃、5% CO2恒温培养箱中培养。取对数生长期的细胞制成细胞悬液,用血球计数板调整浓度约为5×104个/mL。实验分为阳性对照组和酸浆实验组。向96孔细胞培养板中每孔加100 μL细胞悬液,置于细胞培养箱中过夜,使细胞完全贴壁生长。

24 h后加药,实验组加入100 μL不同浓度(12.5、25、50、100、200、400 μg/mL)酸浆样品,以5-氟尿嘧啶(5-FU,1.25、2.5、5、10、20、40 μg/mL)作为阳性对照,每个浓度设3个复孔。培养48 h后,弃去培养液,用PBS轻轻洗涤两次。Alamar Blue贮存液用RPMI1640培养液以1∶10比例稀释,每孔加200 μL,培养箱中孵育4 h后将96孔培养板放于530 nm的激发波长和590 nm的发射波长检测荧光值。按式(2)计算细胞增殖抑制率,由此转换成IC50。不同部位样品抑制肿瘤细胞增殖活性以IC50衡量,IC50值为抑制率50%时的药物浓度。实验重复3次。

式(2)

式中:F代表阴性对照组的荧光值;F0代表样品组的荧光值;F1代表空白组的荧光值。

1.2.5抗炎活性实验采用AlamarBlue法检测酸浆各提取物对小鼠单核巨噬细胞RAW264.7的毒力作用,选择酸浆样品的合适浓度范围,以便进行后续的抗炎实验。确定合适的浓度,取形态均匀状态良好的RAW264.7细胞,胰酶消化后以5×104个/mL接种于96孔培养板,过夜培养使细胞完全贴壁。实验分为空白组、阳性对照组(LPS组)和4个浓度的酸浆实验组。实验组浓度分别为1、2、5、10 μg/mL,空白组和LPS组则给以相同的DMEM培养基,每个浓度设3个复孔。培养2 h后,空白组加入DMEM培养基,LPS组和实验组加1 μg/mL的LPS继续培养24 h。取细胞培养上清液用于NO检测。具体参照说明书进行。实验重复3次。

表1　酸浆五个部位乙醇提取物的抑菌活性±s)

2　结果与分析

2.1酸浆醇提物抑菌活性的对比分析

由表1抑菌结果表明,酸浆根、茎、叶、宿萼和浆果醇提物对不同的菌种表现出不同程度的抑制作用。浆果对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑制效果最强,叶对有枯草芽胞杆菌的抑制效果明显,抑菌圈分别为(16.63±0.49)、(14.97±0.37)、(15.83±0.29) mm。而茎对指示菌的抑制作用较弱。阴性对照丙酮对指示菌株的抑制作用不明显,青霉素作为阳性对照效果良好,表明实验结果较为可信。初步推测,酸浆的浆果对常见病原细菌有较好的抑制效果,而叶作为非可食用部位也值得进一步研究。

2.2酸浆醇提物的抗氧化活性

抗氧化研究发现,酸浆五个部位醇提物活性呈现出良好的浓度依赖性,其中宿萼的抗氧化活性最高,这与Helvaci S等[18]研究发现宿萼具有较高的抗氧化活性结果相似。检测显示5 mg/mL的宿萼对DPPH·的清除率为96.79%±2.09%,基本和同剂量的VC效果相当,这可能与宿萼中的抗坏血酸和黄酮类化合物等抗氧化物质的含量较多有关[19],初步表明宿萼的抗氧化活性值得进一步探究。其次为叶、根和茎,果浆的抗氧化能力相对较弱(图1)。抗坏血酸(VC)作为阳性对照效果良好。

图1　酸浆五个部位乙醇提取物的DPPH自由基清除活性比较Fig.1　Comparison of scavenging activity of ethanol extractsfrom five parts of P. alkekengi L. on DPPH free radicals

2.3酸浆醇提物对肿瘤细胞的影响

由表2可知,以抗肿瘤药物5-FU作为阳性对照,其IC50显示出抗肿瘤效果明显,实验较为可靠。酸浆醇提物对人乳腺癌细胞MCF-7,MDA-MB-231和肝癌细胞株Bel7402有一定的抑制作用,且呈现出良好的浓度依赖性。其中,根和叶对乳腺癌细胞株MCF-7的抑制活性较强,宿萼对乳腺癌细胞株MDA-MB-231抑制较明显,宿萼对肝癌细胞株Bel7402的活性较佳,IC50分别为(31.46±1.49)、(35.24±1.55)、(48.84±1.69)、(65.48±1.82) μg/mL。初步提示酸浆的根、宿萼和叶可能会达到预防和治疗肿瘤的效果,为今后酸浆的功能开发提供实验思路。

表2　酸浆五个部位乙醇提取物的抗肿瘤活性(μg/mL)

2.4酸浆醇提物对炎症细胞RAW264.7的影响

通过Alamar Blue法分析,浓度范围不高于20 μg/mL的酸浆实验组是没有细胞毒性的。RAW264.7细胞经LPS处理形成炎症细胞模型,通过Griess反应测定细胞培养上清中的亚硝酸盐含量,间接地表现酸浆对LPS刺激的RAW264.7细胞NO产生的影响。

如图2所示,阴性对照组的正常细胞NO产生较少,为10.89 μmol/L。RAW264.7细胞经过LPS处理过后NO产生量迅速升高为54.58 μmol/L,但经过1、2、5、10 μg/mL酸浆预处理后,NO的产生明显降低。Kang H等[20]验证了酸浆的甲醇提取物和氯仿分馏得到的提取物具有抗炎活性,本研究不仅探讨出酸浆可能具有抗炎活性,而且表现出一定的浓度梯度依赖性和活性部位的差异性。叶的效果最佳,茎效果最弱,10 μg/mL时,NO产生量分别为11.01和27.73 μmol/L。预示酸浆的叶可能具有抗炎活性,为今后寻找低毒高效的药食植物抗炎药提供参考。

图2　酸浆对LPS诱导的RAW264.7细胞中NO产生的影响Fig.2　Effects of P. alkekengi L. on NO productionin LPS-stimulated RAW264.7 cells

3　结论

酸浆具有一定的抑菌、抗氧化、抗肿瘤、抗炎活性,并具有量效关系。抑菌检测显示,酸浆醇提物对三株菌都有抑制作用,其中浆果对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌效果最明显,叶对枯草芽孢杆菌的抑制活性最强。DPPH法检测发现宿萼的抗氧化活性最高,浓度5 mg/mL时基本和同剂量的VC效果等同。Alamar Blue法检测抗肿瘤活性发现,酸浆根、宿萼和叶的量效关系最为明显,根和叶对乳腺癌细胞株MCF-7的抑制活性最强,宿萼对乳腺癌细胞株MDA-MB-231,宿萼对肝癌细胞株Bel7402的抑制活性最强。抗炎检测中,叶显示出较高的抗炎活性,茎抗炎效果最弱。综上所述,酸浆具有很好的生物学活性,值得进一步开发,以制备低毒副作用小的药品和功能食品。但酸浆各部位成分复杂,其具体活性成分和相关机理,还有待深入研究。

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Comparison study on activities of the ethanol extract from five parts ofPhysalialkekengiL.

DING Pan,LIU Jin-juan,ZHOU Xiao-qi,XUE Ling-wei,SUN Yong,JIANG Ji-hong*

(Key Laboratory of Biotechnology for Medicinal Plant of Jiangsu Province,School of Life Science, Jiangsu Normal University,Xuzhou 221116,China)

Objective:The antimicrobial,antioxidant,anticancer and anti-inflammatory activities of the different parts ofPhysalialkekengiL. were evaluated in this study. Methods:The antimicrobial activities againstStaphylococcusaureus,EscherichiacoliandBacillussubtilisof the alcohol extracts of different parts were investigated using Oxford cup method. The antioxidant activities were evaluated by 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl(DPPH)scavenging assay. The inhibition effects of human cancer cell lines MCF-7,MDA-MB-231 and Bel7402 were detected by Alamar Blue assay. NO assay kit was used to determine the anti-inflammatory activity. Results:The alcohol extract of fruit showed the highest antimicrobial activity againstS.aureusandE.coli. Besides,the alcohol extract of leaves showed the highest antimicrobial activity againstB.subtilis. The diameters of antibacterial circle were(16.63±0.49),(14.97±0.37),(15.83±0.29) mm,respectively. The alcohol extract of calyx exhibited 96.79%±2.09% DPPH radical cavenging efficiency at the concentration of 5 mg/mL,which demonstrated the similar antioxidant activity with the same dose of VC. All alcohol extracts of five parts showed inhibition activities on human cancer cells in a dose-dependent manner. The alcohol extracts of leaves showed better inhibition activities against MCF-7. Furthermore,the calyx showed better inhibition activities against MDA-MB-231 and Bel7402. The IC50were(31.46±1.49),(48.84±1.69)and(65.48±1.82) μg/mL. In addition,the alcohol extract of leaves showed the highest anti-inflammatory activity and the stem was lowest. NO production were 11.01 and 27.73 μmol/L at the concentration of 10 μg/mL. Conclusion:P.alkekengiL. has antibacterial,antioxidant,anti-tumor and anti-inflammatory activity. These results provided theoretical basis for the functional development,further utilization ofP.alkekengiL.

PhysalisalkekengiL.;antibacterial activity;antioxidant activity;anti-tumor activity;anti-inflammatory activity

2016-01-20

丁盼(1986-)，女，硕士研究生，研究方向：药用植物资源与利用，E-mail：dingpan0723@126.com。

蒋继宏(1962-)，男，博士，教授，研究方向：生物技术，E-mail:jhjiang@jsnu.edu.cn。

国家自然科学基金资助项目(31370646)；江苏师范大学自然科学基金(14XLA02)；江苏省药用植物生物技术重点实验室开放课题(KLBMP1404)。

TS201.2

A

1002-0306(2016)16-0113-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.16.014