耐盐芽孢杆菌B11抗菌活性物质的分离纯化及其特征分析

张　帅,邱　鹏,龙秀锋,侯燕燕,鲁凤娟,张鹤铭,田永强

(四川大学轻纺与食品学院皮革化学与工程教育部重点实验室,四川成都 610065)



耐盐芽孢杆菌B11抗菌活性物质的分离纯化及其特征分析

张帅,邱鹏,龙秀锋,侯燕燕,鲁凤娟,张鹤铭,田永强*

(四川大学轻纺与食品学院皮革化学与工程教育部重点实验室,四川成都 610065)

对耐盐芽孢杆菌B11产生的抗菌活性物质进行了分离纯化及特性研究。从盐碱土壤中分离得到一株对金黄色葡萄球菌具有强拮抗活性的耐盐芽孢杆菌B11,其发酵液中抗菌活性物质具有良好的热稳定性、pH稳定性和紫外光照稳定性,100 ℃加热1 h,抑菌活性仅下降11.0%,且在pH为3和11环境下,抑菌活性也仅下降11.4%和10.9%,对酸碱环境具有耐受性。发酵液经预处理、离心、阳离子阴离子交换层析,经正丁醇抽提和半制备高效液相色谱得到活性物质A1和A2,其中A1分子量为1423.8 u且带有多电荷,氨基酸分析仪鉴定A1为非核糖体多肽(NRPS),对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度为8.0 μg/mL;A2活性很弱且含量较低,初步鉴定为小分子抗菌物质,分子量为373 u。耐盐芽孢杆菌B11的抗菌代谢产物应用于食品防腐具有很大的潜力。

耐盐芽孢杆菌,金黄色葡萄球菌,分离纯化,NRPS

金黄色葡萄球菌是食品主要污染菌之一,在我国多地食品检测中均有报道[1-2],可引起许多严重感染,如伪膜性肠炎、肺炎和心包炎等多种疾病[3-4]。由于近几十年抗生素的超量滥用所导致耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的出现,使金黄色葡萄球菌所导致的发病率迅速增高[5],因此在研究有效的治疗方案同时,积极寻找新型抗金黄色葡萄球菌的物质,从食品等传播源头进行防治结合显得尤为紧迫。

近年来,人们对极端环境的微生物开展了广泛的研究,并在Bacillus、Photobacterium、Burkholderia、Aeromonas、Pseudomonas等耐盐细菌的常见种群中都发现了具有抗菌活性菌株的存在[6-7],但对其次级代谢产物的报道却较为有限。迄今为止,仅有少数耐盐细菌的抗菌活性物质被分离纯化,其中包括B.licheniformisBAS50产生的具有表面活性剂作用的脂肽类化合物lichenysin A[8]、L.lactis69产生的乳酸链球菌素[9],H.litoralisYS3106产生的三种具有抗真菌活性的环肽[10],B.subtilisSK.DU.4产生的两种抗革兰氏阳性菌的多肽[11]等肽类抗菌化合物和P.variabilis产生的一组具有抗肿瘤作用的吩嗪类化合物Pelagiomicins A-C[12],B.methylotrophicusMHC10产生的具有广谱抑菌活性的氢醌类化合物[13]等非肽类抗菌活性物质,这与已报道的从其它普通环境中分离的天然产物相比,种类和数量都还太少,故将盐碱环境中微生物的次级代谢产物应用于食品防腐将具有很大的潜力。本课题组前期从盐碱土壤中筛选到一株对金黄色葡萄球菌具有明显抑制活性的耐盐芽孢杆菌B11,并对其进行了发酵条件的优化(另文发表)。在此基础上通过对B11抗菌活性物质的分离纯化和分析鉴定,旨在为将极端环境中的微生物资源应用于食品防腐奠定基础。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

芽孢杆菌B11由新疆莎车县盐碱土壤中分离筛选获得；金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)SIIA1005、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)SIIA1007、大肠杆菌(Escherichiacoli)SIIA1006、白色念珠菌(Candidaalbicans)ATCC90028、肺炎克雷氏菌(Klebsiellapneumoniae)SIIA725等均由四川抗菌素工业研究所微生物资源中心提供;Q-Sepharose FF、SP-Sepharose FF美国GE公司;Daisogel-C18-10 μm型制备色谱柱北京创新通恒科技有限公司;Amethyst C18-H色谱柱赛分科技有限公司;Tris base、甘氨酸上海生工生物技术有限公司;色谱级乙腈、色谱级甲酸成都市科龙化工试剂厂;其它化学试剂均为国产分析纯。

A300自动氨基酸分析仪曼莫博尔公司;Biotech-5L自动发酵罐上海宝兴生物设备工程有限公司;LDZX-40BI型电热蒸汽灭菌锅上海申安医疗器械厂;LC3000型高效液相色谱仪北京创新通恒科技有限公司;PHS-3C型酸度计上海精密科学仪器厂;蛋白层析柱美国Bio-Rad公司;HPS-160生化培养箱东联电子技术开发公司;TGL-16M高速台式冷冻离心机湘仪离心机仪器有限公司;QYC2112旋转式摇床上海福玛公司;ZQ 4000型质谱仪美国Waters公司。

1.2培养基

固体培养基:酵母粉5 g/L、胰蛋白胨10 g/L、NaCl 10 g/L,琼脂粉15 g/L,pH7.0±0.2。

种子培养基:酵母粉5 g/L、胰蛋白胨10 g/L、NaCl 10 g/L,pH7.0±0.2。

发酵培养基:可溶性淀粉15 g/L,黄豆粉15 g/L,NaCl 15 g/L,pH为未调节的自然pH。其中,发酵培养基为前期优化实验得到的抗菌活性最佳培养基。

1.3实验方法

1.3.1菌种活化及发酵参照张丽姣等[14]的方法对菌株B11进行活化并制备种子液,然后按2.5%的接种量将种子液接到4 L的发酵罐中,控制温度37 ℃,转速200 r/min,发酵48 h,得到发酵液。将一定量的发酵液于8000 r/min离心10 min,得到的发酵液上清用于抗菌稳定性研究。

1.3.2发酵上清液的稳定性

1.3.2.1热稳定性将1 mL发酵上清分别置于20、40、60、80和100 ℃下处理1 h,以金黄色葡萄球菌为指示菌,未处理的20 ℃发酵上清为对照,采用杯碟法[15]测定其热稳定性。

1.3.2.2pH稳定性取2 mL发酵上清液,将其pH分别调为3.0、5.0、7.0、9.0和11.0,室温静置1 h。以金黄色葡萄球菌为指示菌,未处理的pH7.0发酵上清为对照,采用杯碟法检测其酸碱稳定性。

1.3.2.3紫外光照稳定性将5 mL发酵上清置于紫外灯下分别照射(照射距离10 cm)0、4、8、12和16 h取样,以金黄色葡萄球菌为指示菌,未处理的发酵上清为对照,采用杯碟法检测其紫外光照稳定性。

1.3.3活性物质的分离

1.3.3.1菌株发酵液预处理将收集到的发酵液用6 mol/L的浓盐酸调节pH至4.0,冷藏于4 ℃静置过夜,然后8000 r/min离心20 min,收集上清液备用。

1.3.3.2活性物质的分离纯化将收集的上清液上样于用10 mmol/L醋酸缓冲液(pH4.0)预平衡的SP-Sepharose FF柱,用1 mol/L氯化钠的磷酸缓冲液(pH6.0、10 mmol/L)洗脱,分步收集具有抗菌活性的洗脱峰。将此洗脱峰调节pH到9.0,上样于10 mmol/L磷酸缓冲液(pH8.0)预平衡Q-Sepharose FF柱,用1 mol/L氯化钠的磷酸缓冲液(pH8.0、10 mol/L)洗脱,收集具有抗菌活性的洗脱峰。在收集的洗脱峰样品中加入等体积的正丁醇抽提多次,直到溶液中的活性物质被完全提取。正丁醇溶液在旋转蒸发仪中于50 ℃减压蒸干,得到固体样品。

1.3.3.3高效液相色谱制备纯品色谱柱为Daisogel-C18(30 mm×250 mm,10 μm),流动相为乙腈和0.15%甲酸水(v/v),梯度洗脱程序见表1,紫外检测波长为254 nm,柱温为25 ℃,流速为20 mL/min,收集抗菌活性峰样品并进行减压浓缩。

表1　梯度洗脱程序

1.3.4抗菌物质的分析检测

1.3.4.1活性物质的质谱检测半制备HPLC分离纯化的抗菌活性物质,用氘代甲醇溶解后,使用ESI-MS检测其分子量及纯度。

1.3.4.2活性物质氨基酸组成的分析分离纯化得到的样品用6 mol/L的HCl于110 ℃水解24 h,然后将水解液全部蒸干,加5 mL 0.02 mol/L的HCl溶解后,0.22 μm滤膜过滤,上A300型氨基酸自动分析仪进行氨基酸组成分析。

1.3.4.3抗菌活性峰的抑菌谱测试取金黄色葡萄球菌SIIA1005、枯草芽孢杆菌SIIA1007、大肠杆菌SIIA1006、白色念珠菌ATCC90028、肺炎克雷氏菌SIIA725作为测试菌株,取经过适当稀释的抗菌纯品物质,采用双层平板法[16]检测其抑菌活性,每个测试菌株设3次重复。

1.3.4.4最小抑菌浓度(MIC)的测定实验采用倍比稀释法将纯化后的抗菌活性物质进行稀释,使其终浓度为128～0.125 μg/mL,并分别加入50 μL到指示菌平板上,观察抑菌圈的出现情况。阴性对照为无菌水,阳性对照为氨苄青霉素,每个处理3个平行。将指示菌平板置于37 ℃培养12 h,能抑制培养基内指示菌生长的最低浓度即为MIC值[17]。

1.3.5统计学分析采用SPSS 19.0统计软件处理实验数据,单因素方差分析进行显著性实验,并用LSD法进行组间的差异性比较,p<0.05表示差异显著而具有统计学意义。

2　结果与分析

2.1菌株B11发酵上清抗菌稳定性研究

热稳定性结果见图1(a)。经SPSS 19.0分析,在温度为20～100 ℃时,菌株B11发酵上清的抗菌活性无显著性差异(p>0.05),表明其热稳定性良好,且抗菌物质对100 ℃高温有一定的耐受性,抗菌活性与对照(20 ℃)相比仅下降11.0%。pH为7.0时,上清液对金黄色葡萄球菌的抗菌活性最强,在pH为3.0和11.0条件下,抗菌活性与对照(pH=7)相比下降11.4%和10.9%,在p<0.05水平上差异不显著,说明菌株B11发酵液的抗菌活性具有良好的酸碱耐受性(图1b)。此外,该菌发酵上清液经紫外光照射,和原液进行对比,其抑菌活性无明显变化(图1c)(p>0.05)。

图1　菌株B11发酵上清液的抗菌稳定性Fig.1　Antimicrobial stability of fermentation supernatant of Bacillus sp. B11

2.2活性物质的分离纯化

2.2.1阳离子交换层析从图2可知,SP-Sepharose FF柱上洗脱出两个吸收峰,通过分段收集并进行抗菌活性检测,可知抗菌活性峰主要集中在125～150 min之间。经强阳离子层析交换,可初步达到抗菌活性物质的富集和纯化,使样品的体积浓缩了3倍。

图2　SP-Sepharose FF强阳离子交换层析谱图Fig.2　The chromatogram of SP-Sepharose FF cation-exchange chromatography

2.2.2阴离子交换层析将从阳离子交换柱洗脱下来的活性物质上Q-Sepharose FF离子交换柱,得到的洗脱曲线如图3所示,分别在27 min和38 min处出现洗脱峰,收集两个峰样品进行抗菌活性测试,得知抗菌活性物质包含在38 min的吸收峰内。通过阴离子交换,进一步纯化和浓缩了样品。

图3　Q-Sepharose FF 强阴离子交换层析谱图Fig.3　The chromatogram of Q-Sepharose FF anion-exchange chromatography

2.2.3正丁醇抽提和旋蒸浓缩将阴离子交换层析收集的38 min吸收峰处样品,用等体积正丁醇抽提多次,合并提取液后旋转蒸发浓缩,得到浅黄色固体,总量约200 mg。正丁醇抽提去掉了不溶于正丁醇的杂质和离子交换层析带入的盐分。

2.2.4半制备高效液相收集旋蒸得到的固体经去离子水溶解后,进行半制备高液收集纯品(图4),可以看到在22 min左右有一个相当高的峰出现,其原因可能是含量太高导致出现了平头峰。为了保证样品的纯度,实验选择在该峰的峰尖进行收集(即收集在2000 mV吸收值以上的液体),并对主峰后面出现的小峰也分别收集和活性检测。通过活性检测知22 min处的峰具有很强的活性,而36 min处的小峰虽也具活性但活性很弱且收集的量很少。对收集到的活性峰样品进行蒸干浓缩后,可知约4 L的发酵液经分离纯化后共得到29 mg活性纯品物质,其中22 min处的活性物质A1约28 mg,36 min处活性物质A2约1 mg。

图4　抗菌物质的制备液相色谱上的分离Fig.4　Purification of antimicrobial substances on preparative HPLC

2.3抗菌物质的分析检测

2.3.1抗菌活性物质的分子质量通过ESI-MS检测(见图5),在A1的质谱图中共出现两组峰,分别选取其中最高的峰,质荷比为712.9 和1424.8,由于存在两倍关系可判断其分别为[M+2H]2+和[M+H]+,所以得到A1的分子量为1423.8 u;又因其分子质量较大,且带有多电荷,可初步判断该抗菌组分可能为多肽。又测得A2的分子量为373 u,但由于其活性较小且含量太少,则还需进行后续的纯化和收集样品分析。

图5　抗菌物质A1和A2的质谱图Fig.5　Mass spectra of antimicrobial substance A1 and A2

2.3.2抗菌多肽氨基酸组成的分析将抗菌肽A1的氨基酸组成谱图与标准混合样进行对照,根据保留时间的一致性,可确定样品中的氨基酸的组成(图6)。标准混合样品的上样量为20 μL,其中每种游离氨基酸的含量为2 nmol,依据标准混合样中每种氨基酸的峰面积及校正因子可计算样品中各个氨基酸残基量。

图6　氨基酸分析谱图Fig.6　The spectrogram of amino acid analysis注:图A为标准氨基酸混合样图谱,图B为样品A1的水解产物图谱;1.Asp，2.Glu，3.Cys，4.Ile，5.Leu，6.Phe，7.His，8.Orn，9.Lys，10.。

表2　抗菌肽A1的氨基酸组成分析

由表2可知,抗菌肽A1经过水解后,共得到天冬氨酸、胱氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、组氨酸、异亮氨酸、鸟氨酸和赖氨酸9种氨基酸。由于酸水解会使天冬酰胺和谷氨酰胺脱酰基化,并分别氧化为天冬氨酸和谷氨酸,且测试结果中含有天冬氨酸和谷氨酸,所以样品中也可能含有天冬酰胺和谷氨酰胺这两种氨基酸。鉴定结果中出现了非天然氨基酸鸟氨酸,而在核糖体合成的多肽和蛋白质中不具有鸟氨酸残基[18],所以初步鉴定抗菌活性物质可能为非核糖体合成的多肽。

2.3.3纯化后抗菌肽的抑菌活性对分离得到的纯品A1进行抗菌活性谱的测试结果见表3。由测试结果可以看出,分离得到的非核糖体多肽A1对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌等革兰氏阳性致病菌具有强的抑菌活性,对大肠杆菌、肺炎克雷氏菌等革兰氏阴性致病菌和白色念珠菌等病源真菌无抑制活性。

表3　抗菌肽A1的抗菌谱

注:++表示抑菌圈直径在15～20 mm,+++表示抑菌圈直径在20～25 mm,-表示无抑菌活性。

2.3.4最小抑菌浓度的测定以金黄色葡萄球菌为指示菌检测结果发现,当抗菌活性物质浓度小于8.0 μg/mL时,指示菌平板上无抑菌圈产生;当抗菌活性物质浓度大于8.0 μg/mL时,平板上出现抑菌圈,且随着抗菌活性物质浓度的增大抑菌圈直径逐渐增大。因此,纯化的抗菌肽对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度为8.0 μg/mL,稍弱于阳性对照氨苄青霉素(6.25 μg/mL)。

3　讨论

通过对耐盐芽孢杆菌B11的活性物质进行分离纯化,得到对革兰氏阳性致病菌具有明显抑制作用的A1,并经鉴定为非核糖体多肽(NRPS),这与Biscola等[9]分离得到的核糖体多肽类抗菌化合物和Jeyanthi等[12]分离得到的非肽类抗菌化合物存在差异。对于耐盐菌所产抗菌活性物质的多样性,可能是由于耐盐细菌特殊的生存环境,使其形成了独特的生理结构和代谢途径,从而可产生肽类[8-9,11](核糖体肽和非核糖体肽)、芳烃类[12-13]和聚酮类[19-20]等多种类型的抗菌活性物质。实验目前只完成了耐盐芽孢杆菌B11所产抗菌物质的分离纯化和初步鉴定,下一步还需通过其它表征手段(碳谱、氢谱和二维谱等)明确抑菌物质的结构,同时探求其抑菌机制及在细胞内的合成机理,从而使极端环境微生物的代谢物能更好的在食品防腐领域得到应用。

4　结论

通过阳离子交换层析、阴离子交换层析、正丁醇抽提和旋蒸浓缩、半制备高效液相色谱从预处理后的耐盐芽孢杆菌B11发酵液中分离纯化得到2个具有抗菌活性组分A1和A2,并通过质谱检测得到其分子量分别为1423.8 u和373 u。A1分子量较大并带有多电荷可判断为多肽,氨基酸分析测得其含有9种氨基酸,因氨基酸组成中含有鸟氨酸,可初步鉴定A1为非核糖体多肽(NRPS)类抗菌物质,对革兰氏阳性致病菌有强的抗菌活性,所表现的抗菌活性具有良好的热稳定性、pH稳定性和紫外光照稳定性。抗菌肽A1对金黄色葡萄球菌表现出较高的抑菌活性,MIC为8.0 μg/mL。A2分子量为373 u,可初步鉴定为小分子抗菌物质。

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Isolation and purification of antimicrobial substance fromBacillussp. B11 and analysis of its properties

ZHANG Shuai,QIU Peng,LONG Xiu-feng,HOU Yan-yan,LU Feng-juan,ZHANG He-ming,TIAN Yong-qiang*

(Key Laboratory of Leather Chemistry and Engineering,Ministry of Education and College of Light Industry,Textile & Food Engineering,Sichuan University,Chengdu 610065,China)

Study the purification and characterization of antimicrobial substance fromBacillussp. B11. A halotolerant bacterium B11 isolated from saline-alkali soil showed strongly antagonistic againstStaphylococcusaureus,and its antimicrobial substance showed excellent stability towards pH,temperature and ultraviolet. The antimicrobial activity was not influenced disposing for 1 h under 100 ℃,and only 11.0% loss of activity was suffered. After treatment at pH3 and pH11,antimicrobial activities decreased 11.4% and 10.9%,respectively,which indicated the antimicrobial substance ofBacillussp. B11 was stable to acid and alkali. Fermentation broth was used to isolate antimicrobial substances with a procedure involving pretreatment of fermentation broth,cation-exchange chromatography,anion-exchange chromatography,rotary evaporation after butanol extraction,and preparative HPLC on C18 column. Two elution peaks,named A1 and A2,which possessed the antimicrobial activity were eluted with preparative HPLC,and the molecular weight of multi-charge A1 was 1423.8 u. The purified antimicrobial peptide A1 was determined as non-ribosomal synthetic peptide(NRPS)by amino acid analyzer,and its minimum inhibitory concentration againstStaphylococcusaureuswas 8.0 μg/mL. At the same time,the antimicrobial substance A2 was determined as low-molecular-weight antibiotic substance combined its antimicrobial activity and molecular mass,and its molecular mass was 373 u. Therefore,the antibacterial metabolites from halotolerant bacterium B11 may have potential application in food industry.

salt-tolerant bacillus;Staphylococcusaureus;isolation and purification;NRPS

2016-03-23

张帅(1991-)，男，硕士研究生，研究方向:微生物药学，E-mail:zsscuu@163.com。

田永强(1971-)，男，副教授，研究方向:生物工程，E-mail:yqtian@scu.edu.cn。

中央高校基本科研业务费专项资金资助 (SCU2015D008)；四川应用基础研究计划项目 (2014JY0199)。

TS201.3

A

1002-0306(2016)18-0256-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.18.040