对映-贝壳杉烷二萜化合物KamebacetalA诱导人肝癌细胞Hep-G2凋亡的荧光检测

徐德萍　李国铎　梁勤

对映-贝壳杉烷二萜化合物KamebacetalA诱导人肝癌细胞Hep-G2凋亡的荧光检测

徐德萍李国铎梁勤

目的：验证香茶菜中天然二萜化合物具有诱导细胞凋亡及抑制肿瘤生长的作用。方法：选用二萜化合物Kamebaceta⁃lA对Hep-G2细胞进行诱导，Hoechst33258荧光染色，观察细胞凋亡情况。结果：低浓度药物处理细胞72h，即出现早期凋亡形态特征，中浓度药物处理24h，即出现典型的凋亡小体。高浓度药物处理细胞72h，细胞已完全崩解成碎片。结论：二萜化合物Kamebac⁃etalA具有诱导肿瘤细胞凋亡的作用，且凋亡细胞的形态学特征随药物浓度的升高和处理时间的延长而愈加明显。

对映-贝壳杉烷二萜化合物；KamebacetalA；细胞凋亡；Hep-G2

从香茶菜属植物中提取的二萜化合物中多数具有显效的抗癌作用，对映-贝壳杉烷类二萜化合物是香茶菜属植物的主要次生代谢物，含量极为丰富，当地民间用其治疗肺脓疮，疗效显著，天然植物二萜化合物的细胞毒活性主要表现在引起肿瘤细胞凋亡［1-3］。本文采用形态学观察法检测植物二萜化合物的细胞毒活性，用几种香茶菜中摄取的二萜化合物处理癌细胞后，利用荧光染料Hoechst 33258染色后用荧光显微镜观察。荧光染料Hoechst 33258与DNA特异结合的活性染料，以非嵌入式结合在DNA的A-T碱基区，紫外光激发时发射蓝色荧光。该实验中，KamebacetalA处理后的细胞在荧光显微镜下可见细胞核染为高亮蓝色的典型凋亡小体，其细胞核明显固缩、凝聚和断裂。

1　材料与方法

1.1细胞和被试化合物Hep-G2细胞株和对映-贝壳杉烷二萜化合物KamebacetalA均由西北师范大学生命科学院提供。化学结构见图1。

图1　KamebacetalA的化学结构式

1.2主要试剂及仪器合成培养基RMPI-1640购自Gibco，胰蛋白酶购自Sigma，新生小牛血清购自杭州四季青生物技术有限公司，其他化学试剂均为分析纯。Hoechst33258贮存液：称取Hoechst33258试剂1mg，用1ml蒸馏水溶解后，滤过，4℃避光保存。用时蒸馏水100倍稀释成工作液。细胞固定液：甲醇/冰乙酸（3：1），PBS缓冲液：PH=7.4。美国Costar 24孔板，超净工作台，CO2饱和湿度恒温箱，倒置显微镜，荧光显微镜，高速离心机。

1.3实验方法

1.3.1细胞培养［4］。取Hep-G2细胞常规培养于RP⁃MI1640培养液中，内含10%胎牛血清及青霉素和链霉素各100IU/ml，置于37℃、含5%CO2的饱和湿度空气中培养。

1.3.2接种细胞株与药物作用。取对数生长期Hep-G2细胞，加入0.6%胰蛋白酶消化分散，用完全培养基（体积分数为90%的PRMI-1640合成培养基+体积分数为10%的小牛血清）制成单个细胞悬液，计数（标准浓度为1×105个/ml）接种于24孔板上，每孔1ml。置37℃、5%CO2的饱和湿度培养箱中培养24 h加药，Kame⁃bacetalA浓度分别为0（对照组）、5、10、15、20μmol/L。

1.3.3Hoechst33258染色。收集代谢液于离心管中后，每孔加入0.6%胰蛋白酶消化后，收集细胞（1000r/ min离心5min），去上清，PBS洗2次后。加入300μl固定液4℃固定30 min。2000r/min离心10min弃去上清，用30μl的Hoechst33258工作液重悬细胞，染色5分钟后，压片，荧光显微镜下观察。

2　结果

由图2看出，对照组细胞经染色后细胞形态完整，呈均一蓝色（图A）。用10μmol/L KamebacetalA处理72h，出现早期凋亡形态特征，染色质开始凝集（图B）。15、20μmol/L KamebacetalA处理24h，出现典型的凋亡小体（图C、E）。15μmol/L KamebacetalA处理细胞48h，细胞膜破损，细胞已经坏死（图D），当20μmol/L KamebacetalA处理细胞72h，细胞已完全崩解成碎片，在荧光显微镜下看不到完整的细胞。

图2　Hoechst33258染色检测KamebacetalA诱导细胞凋亡

3　讨论

细胞凋亡是维持内环境稳定、由基因控制的细胞自主有序性的死亡，具有重要的生物学意义。恶性肿瘤的发生发展与肿瘤细胞的无限增殖及凋亡受阻有关，因此，诱导肿瘤细胞凋亡是一种有效的肿瘤治疗手段，也成为筛选抗肿瘤药物的一个重要指标。天然二萜化合物所具有的细胞毒活性主要表现在引起肿瘤细胞凋亡。

对Hep-G2细胞加药培养24h后，在倒置显微镜下观察各药物处理组及对照组细胞状态的变化情况。药物处理24 h后，处理组的细胞与对照组相比，其倒置显微镜下的形态特征发生变化，药物处理组细胞的生长受到明显抑制，细胞轮廓增强，细胞质中开始出现颗粒状物质，并有少量细胞开始脱落；随着药物浓度的增高，癌细胞生长完全停止，并出现细胞回缩，贴壁细胞相互间隙加大，胞内充满颗粒堆积，大部分细胞脱落而漂浮于培养液中。上述药物处理后细胞的生长状况表明：较低浓度的药物处理时可抑制Hep-G2细胞的生长，在较高浓度时则可致细胞死亡。

另外，本实验采用Hoechst33258荧光染色法对凋亡细胞进行形态学观察，研究发现用KamebacetalA处理Hep-G2细胞可得到较明显的凋亡效果，该药物具有较强的抗肿瘤药理活性。同时，实验结果显示药物处理时间与药物浓度对凋亡程度也有显著影响，由图2和图3可见低浓度药物处理Hep-G2细胞时，24小时之内细胞凋亡不明显；48h后，10μmol/L和15μmol/L KamebacetalA能诱导大多数细胞出现典型的凋亡小体，提示此阶段为药物诱导作用的高峰时期，用最高浓度药物处理72h后已很难观察到正常细胞，大多数细胞已经崩解、弥散、呈碎片状。总之，以上结果表明作用时间、药物浓度均与细胞凋亡程度有关，在较宽的浓度范围内二萜化合物均可诱导Hep-G2细胞凋亡，而检测时间以48小时左右为佳。

本研究证实了植物天然二萜化合物对肿瘤细胞产生的凋亡诱导作用，并且初步探讨了出现明显凋亡现象所需的药物浓度及作用时间，为临床用药提供了一定的参考。

［1］刘苏，徐海伟，刘宏民.具有抗肿瘤活性的天然二萜类化合物［J］.中国科技信息，2005（20）：56-57.

［2］刘志平，崔建国，黄初升.具有抗癌活性含氮天然产物的研究进展［J］.天然产物研究与开发，2006，18（1）：144-150.

［3］石浩，何山，何兰，等.大萼香茶菜中的新二萜化合物［J］.高等学校化学学报，2007，28（1）：100-102.

［4］丁兰，第五佳丽，田继东，等.对映-贝壳杉烷型二萜化合物Wangzaozin A对人早幼粒白血病HL-60细胞生长抑制和凋亡诱导的作用［J］.第三军医大学报，2013，35（8）：727-732.

［5］郭丽萍，王坚，蒋雨平，等.胰岛素可抵抗MPP+诱导的PC12细胞的凋亡［J］.中国临床神经科学，2004，12（2）143-146.

［6］刘小山，臧林泉，蒿自睿，等.海洛因诱导大脑神经元凋亡的研究［J］. Journal of Forensic Medicine，2007，23（1）14-17.

A

1004-2725（2016）10-0770-02

工作单位：730050甘肃兰州，甘肃省中医院检验科

徐德萍，E-mail：546378746@qq.com