响应面法优化冬虫夏草菌产多糖液体发酵培养基

邵紫培，赵莹，袁洪水

（河北农业大学生命科学学院，河北保定071000）

科学实验研究

响应面法优化冬虫夏草菌产多糖液体发酵培养基

邵紫培，赵莹，袁洪水*

（河北农业大学生命科学学院，河北保定071000）

本试验应用响应面法对冬虫夏草菌CC-10液体发酵培养基进行优化，以提高胞内多糖含量同时降低生产成本。试验以多糖含量为响应值，先通过单因素试验确定最适碳源和氮源，采用Plackett-Burman试验从7个培养基组分中筛选出主要影响因素，爬坡试验逼近最佳响应值区域，最终通过Box-Behnken Design和响应面分析确定主因素的最优浓度。结果表明：冬虫夏草菌CC-10产多糖的最适碳源为麦芽糖，最适氮源为蛋白胨，综合菌株生长特性和生产成本，选择葡萄糖、麦芽糖组合碳源和蛋白胨、豆饼粉组合氮源；确定葡萄糖、麦芽糖、蛋白胨3个主因素，得到最优的产多糖培养基为葡萄糖9.3 g/L、麦芽糖18.8 g/L、蛋白胨6.1 g/L、豆饼粉4 g/L、KH2PO41 g/L、MgSO40.5 g/L、核黄素0.5 mg/L。优化后的多糖含量为4.23%，是优化前的2.06倍。试验为后续大规模发酵生产提供理论参考。

响应面法；冬虫夏草菌；多糖；培养基优化

冬虫夏草是由冬虫夏草菌侵染青藏高原山草甸土中的蝙蝠蛾科昆虫的幼虫而形成的虫草复合体（许亮等，2011）。冬虫夏草富含多糖、核苷、氨基酸和无机元素等多种活性物质，保健防病作用显著，但是其生长环境特殊，自然资源匮乏，价格昂贵。研究表明，人工发酵后的冬虫夏草菌丝体与天然冬虫夏草成分相似，多糖类、核苷类等药用成分的含量甚至高于天然冬虫夏草，且二者具有相同的功效和药理作用（石岩等，2013；詹小涛等，2012）。邵紫培等（2016）用CC-10冬虫夏草菌粉饲喂肉鸡，结果显示0.1%或0.2%添加量均能提高肉鸡的免疫功能和生长性能。本试验对CC-10菌株产多糖液体发酵培养基进行优化，期望可以在提高胞内多糖含量的同时降低生产成本，为将来更好地应用于畜牧生产提供理论参考。

1　材料与方法

1.1试验材料

1.1.1菌株冬虫夏草菌CC-10，保藏于河北农业大学生命科学学院制药工程实验室。

1.1.2培养基PDA加富培养基。

种子液体培养基：葡萄糖20 g/L、蛋白胨10 g/L、KH2PO41 g/L、MgSO40.5 g/L，pH值6.7。

基础发酵培养基：碳源26 g/L、氮源10 g/L、KH2PO41 g/L、MgSO40.5 g/L、核黄素0.5 mg/L，pH值6.7。

1.2试验方法

1.2.1培养方法种子液制备：挖取已活化的CC-10菌种1～2 cm2接种于种子培养基中，装液量为100 mL/500 mL，26℃、180 r/min摇床培养4 d。

发酵液制备：将种子液以10%（V/V）的接种量接种于发酵培养基中，装液量为100 mL/500 mL，26℃、180 r/min摇床培养5 d。

将发酵液离心，菌丝体60℃烘干至恒重，粉碎，过60目筛，即为检测样品。

1.2.2多糖含量测定取冬虫夏草菌粉，用80%乙醇脱脂，除去单糖和低聚糖，加入适量的超纯水，90℃超声提取4次，1 h/次，浓缩，Sevage法除去蛋白，加入4倍体积95%的乙醇，静置24 h，离心收集沉淀，用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤，冷冻干燥，得到冬虫夏草菌丝体精制多糖（穆文静等，2011）。标准曲线的绘制参照黎晶晶和徐格非（2008）的方法。

菌丝体多糖含量测定采用苯酚-硫酸法：取0.1 mL样品多糖溶液置于试管中，补加蒸馏水至体积为1 mL，之后操作同标准曲线制作，将所得吸光度带入标准曲线得多糖浓度，并计算菌丝体中多糖含量。

1.2.3单因素试验以菌丝体多糖含量为指标，分别以葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、麦芽糊精为唯一碳源，种子液以7%的接种量接种，26℃、180 r/min摇床培养5 d。以最优碳源为基础，分别以牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、蚕蛹粉、豆饼粉为唯一氮源，以相同发酵条件进行发酵试验，测定菌丝体多糖含量。

1.2.4Plackett-Burman（PB）试验设计PB设计是一种近饱和的2水平的试验设计方法，每个变量选取高（+）、低（-）两个水平，包括虚拟变量在内共计11个变量，分别为X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8、X9、X10、X11，经Design-expert 8.05软件设计后，会产生12次试验，最终得到一个多元一次回归方程。

1.2.5最陡爬坡试验最陡爬坡试验的爬坡方向与试验值变化的梯度方向一致，变化步长由各因素效应值的大小决定，能快速、经济地逼近最佳值区域（Montgomery等，1991）。

1.2.6Box-Behnken Design（BBD）试验设计通过进行三因素三水平（-1，0，+1）试验得到包括一次项、平方项和交互项的多元二次回归方程。采用Design-expert 8.05软件绘制响应面立体分析图，得出响应值的最优值和各因素的最优水平。所得到的参数需进行多次重复试验，以验证模型的可靠性，并确定最终的优化结果。

2　结果与分析

2.1单因素试验结果

2.1.1碳源对菌丝体多糖含量的影响由图1可知，CC-10菌株能在不同程度上利用葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖，而不能有效利用麦芽糊精产生胞内多糖。其中，以麦芽糖为发酵培养基唯一碳源时，菌丝体多糖含量最高，为（2.36±0.14）%，而以葡萄糖为单一碳源时，多糖含量为（2.00±0.24）%，并且葡萄糖价格较麦芽糖低，所以选择葡萄糖和麦芽糖作为组合碳源进行后续试验。

图1　碳源对多糖含量的影响

2.1.2氮源对菌丝体多糖含量的影响由图2可知，CC-10菌株能不同程度利用牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、蚕蛹粉、豆饼粉，其中，以蛋白胨为唯一氮源时，菌丝体多糖含量最高，可达（2.75± 0.34）%。综合考虑菌株生长特性和工业化生产成本，选用价格较为低廉的豆饼粉与蛋白胨共同作为后续研究的氮源。

图2　氮源对多糖含量的影响

表1　Plackett-Burman试验设计与结果

2.2PB试验筛选主效应因子结合单因素试验结果，本研究选取7个潜在的影响CC-10菌丝体多糖含量的因素为实际变量，包括葡萄糖（X1）、麦芽糖（X2）、蛋白胨（X3）、豆饼粉（X4）、MgSO4（X5）、KH2PO4（X6）、核黄素（X7），并余4个虚拟变量X8、X9、X10、X11作为误差分析来进行PB试验。PB试验设计和结果见表1，每个因素包括高低两个水平，每组试验3个重复取平均值。

由表2可知，该模型极显著（P=0.0064＜0.01）。在90%的置信区间内，对胞内多糖含量有显著影响的因素依次为麦芽糖＞蛋白胨＞葡萄糖，三个因素均表现为负效应，浓度可适当降低，作为发酵优化的主要因素，进行后续响应面分析。其他四种因素对胞内多糖含量影响不显著，为降低生产成本，应维持在低水平。各因素经回归分析，得多元一次方程：

表2　Plackett-Burman设计各因素效应分析和评价

经方差分析，该模型Prob＞F值为0.0064，所得回归方程极显著，证明该模型在所研究区域拟合良好。决定系数R2为97.08%，调整性决定系数Adj R2为91.98%，进一步证明了该模型的可靠性。精密度显示的是信噪比，其值大于4.0视为合理，本试验精密度达14.001。

2.3最陡爬坡试验为了逼近多糖含量最高的区域，根据PB筛选出的主效应值的大小及正负进行了爬坡试验。由表3可知，当葡萄糖、麦芽糖、蛋白胨浓度分别为9、19、6 g/L时，多糖含量达到最高4.17%，表明最高多糖含量区在第4组试验附近。

表3　最陡爬坡试验设计及结果

2.4Box-Behnken中心组合试验结果与分析

2.4.1Box-Behnken中心组合试验结果根据最陡爬坡试验结果，选择第4组作为Box-Behnken中心组合试验的中心点，利用Design-Expert 8.05软件设计3因素3水平，共17个试验点的中心组合试验，共包括12个析因点和5个零点重复，试验设计及结果见表4。

利用Design-Expert 8.05软件对中心组合试验结果进行响应面分析，得到多糖含量（Y）对葡萄糖（A）、麦芽糖（B）、蛋白胨（C）的多元二次回归方程：

表4　Box-Behnken试验设计及结果

回归方程及模型相关显著性分析见表5。由表5可见，CC-10菌株产胞内多糖响应面试验模型Pr=0.0010＜0.01，说明方程拟合度较好，在α= 0.01水平上回归极显著；失拟项误差为0.1288＞0.05，表明失拟不显著，残差是由随机误差引起，证明该模型选择较合适；复相关系数R2=0.9492，说明预测值和试验值之间相关性高度一致；调整性决定系数Adj R2=0.8840，表明该模型可信度很高，可以很好地描述试验结果。由表5可知，因素A、B、C对产多糖的线性效应均不显著；因素A2、B2、C2对产多糖的曲面效应均显著；因素A、C和B、C之间对产多糖的交互影响均不显著，而因素A、B之间对产多糖的交互影响显著。

2.4.2CC-10菌株产多糖响应面分析利用Design-Expert 8.05软件根据多元二次回归方程绘制了相应的三维响应曲面和等高线图（图3～5），用该图对影响多糖产量的任何两种因素之间的交互效应进行分析，进而确定最佳因素水平。

表5　响应面试验方差结果分析

图3　葡萄糖和麦芽糖对多糖含量交互影响的三维曲面图（A）和等高线图（B）

由图3可知，葡萄糖和麦芽糖对多糖含量的影响显示，当蛋白胨含量为6 g/L时，多糖含量随着二者含量的增加先升高后下降，趋势一致，但是沿葡萄糖方向的等高线密度大于沿麦芽糖方向的等高线密度，说明在一定范围内增加葡萄糖的量比增加麦芽糖的量更有效。同时可以看出等高线接近椭圆，说明两者交互作用显著（P＜0.05）。由图4可知，葡萄糖和蛋白胨对多糖含量的影响显示，当麦芽糖含量为19 g/L时，多糖含量随着二者含量的增加先升高后下降，但是沿蛋白胨方向的等高线密度大于沿葡萄糖方向的等高线密度，说明在一定范围内增加蛋白胨的量比增加葡萄糖的量更有效。但是等高线不接近椭圆，说明两者交互作用不显著（P＞0.05）。由图5可知，麦芽糖和蛋白胨对多糖含量的影响显示，当葡萄糖含量为9 g/L时，多糖含量随着二者含量的增加先升高后下降。但是等高线不接近椭圆，说明两者交互作用不显著（P＞0.05）。

图4　葡萄糖和蛋白胨对多糖含量交互影响的三维曲面图（A）和等高线图（B）

图5　麦芽糖和蛋白胨对多糖含量交互影响的三维曲面图（A）和等高线图（B）

2.4.3CC-10菌株产多糖响应面结果的优化分析与条件验证回归方程对CC-10菌株产多糖响应面试验拟合良好，因此可用回归方程对此试验结果进行优化分析。采用Design-Expert 8.05软件获取多糖含量最大值，步骤如下：Optimization→Numerical→Criteria中选取“多糖含量”，Goal中选择maximize，设置Upper为6，Lower为默认→Solutions中可得到最大值为4.2318%，此时，葡萄糖含量为9.32 g/L、麦芽糖含量为18.79 g/L、蛋白胨含量为6.14 g/L，实际试验中添加量为葡萄糖9.3 g/L、麦芽糖18.8 g/L、蛋白胨6.1 g/L。为了验证多糖含量模型的有效性和实用性，利用最佳发酵培养基进行6次验证试验，测得多糖含量的平均值为（4.16±0.15）%，与预测结果基本一致，因此该模型能较好地预测实际发酵情况。优化前多糖含量为2.05%，利用最优发酵培养基发酵胞内多糖含量是未优化的2.06倍。

3　讨论

虫草多糖对免疫系统具有增强作用，具体表现为能促进淋巴细胞的转化和刺激腹腔吞噬细胞的吞噬功能，进而提高机体免疫力（郎久义等，2008）。胡雅婷等（2004）利用虫草菌粉饲喂雏鸡，结果显示，中、高剂量（0.6、1.8 g/kg）虫草菌粉能够极显著提高淋巴细胞转化率。王米等（2015）研究表明，合适浓度的蛹虫草多糖能促进小鼠腹腔巨噬细胞产生NO、NOS和iNOS以及TNF-α，从而增强巨噬细胞的功能。本研究以冬虫夏草菌CC-10液体发酵产多糖为优化指标进行响应面试验，优化后的胞内多糖含量达4.23%，是优化前的2.06倍，可以用于生产更优的饲料添加剂。

培养基的优化常采用正交试验法和响应面法，正交试验法可同时考虑多个因素并且寻找最佳因素水平组合，但是无法得到因素与响应值在整个区域的一个明确回归方程，因而无法得到最佳组合和响应值的最优值。响应面法可用来确定试验因素及因素间的交互作用对试验过程中响应值的影响，通过回归方程及三维曲面图能准确、清晰地得出最优试验因素及响应值，因此应用广泛。陈雄等（2009）利用响应面法优化地衣芽孢杆菌A2发酵培养基，优化后发酵液中A2的活菌含量达1.30×1011cfu/mL，比优化前提高了近3倍。王飞等（2007）采用响应面法优化北虫草产多糖液体发酵培养基，优化后培养液多糖含量为1.977×10-2g/mL。本试验先采用单因素试验确定了最佳碳源、氮源的种类，进而利用响应面法优化CC-10菌株产多糖液体发酵培养基，优化后胞内多糖含量为4.23%。

4　结论

本试验采用响应面法优化冬虫夏草菌CC-10产多糖液体发酵培养基，经响应面分析确定了最优培养基为葡萄糖9.3 g/L、麦芽糖18.8 g/L、蛋白胨6.1 g/L，通过多元二次回归方程分析，该模型回归显著，拟合度良好，为后续大规模发酵生产提供了理论参考。

［1］陈雄，袁金凤，王志等．响应面法优化地衣芽孢杆菌A2发酵培养基［J］．中国饲料，2009，7：17～20．

［2］胡雅婷，潘美慧，李进进，等．虫草菌粉对雏鸡细胞免疫功能的影响［J］．国外畜牧学（猪与禽），2014，34（6）：52～53．

［3］郎久义，付燕，吴凌，等．虫草多糖的生物活性及其在家禽中的应用［J］．中国家禽，2008，17（30）：29～31．

［4］黎晶晶，徐格非．苯酚-硫酸法测定灵芝多糖含量的研究［J］．杭州化工，2008，38（1）：23～26．

［5］穆文静，杜玲，扈瑞平，等．钝顶螺旋藻多糖Sevage法脱蛋白工艺的研究［J］．内蒙古石油化工，2011，10：1～4．

［6］邵紫培，尹艳军，袁洪水．冬虫夏草菌粉对肉鸡生长性能和免疫功能的影响［J］．饲料工业，2016，4（37）：10～14．

［7］石岩，魏锋，马双成．冬虫夏草及其菌丝体药理作用研究概况［J］．中国药事，2013，27（8）：847～875．

［8］王飞，刘霞，陈明辉．响应面法优化北虫草产多糖液体发酵培养基［J］．安徽农业科学，2007，35（8）：2218，2224．

［9］王米，张丽芳，费陈忠，等．蛹虫草多糖对小鼠腹腔巨噬细胞免疫功能的影响［J］．中国生化药物杂志，2015，4（35）：10～12．

［10］许亮，杨燕云，王荣祥，等．冬虫夏草用药部位描述的商榷［J］．中国试验方剂学杂志，2011，17（4）：254～255．

［11］詹小涛，赖桂萍，朱德霞．冬虫夏草及其发酵菌丝体药理作用研究进展［J］．医学综述，2012，18（10）：1566～1569．

［12］Montgomery D C．Design and analysis of experiments（3rd ed）［M］.New York：John Wiley＆Sons，1991：35～40.

In order to enhance cell yield of polysaccharide and reduce production cost，this study used response surface methodology to optimize liquid fermentation medium of Cordyceps sinensis CC-10 strain.Taking the content of polysaccharide as response value，the single-factor design was used to screen the suitable carbon and nitrogen source. Plackett-Burman design was employed to screen main influence factors from seven medium components.Then the steepest ascent experiment was used to approach maximum response area.Last optimum levels of critical variables were determined by Box-Behnken Design.The results showed that maltose and peptone were screened as the optimal carbon source and nitrogen source，respectively.Considering the growth characteristics of CC-10 strain and production cost，combination carbon source of glucose and maltose，combination nitrogen source of peptone and bean cake powder were chose.Glucose，maltose and nitrogen were identified as main influencing factors，the optimized composition were：glucose 9.3 g/L，maltose 18.8 g/ L，peptone 6.1 g/L，bean cake powder 4 g/L，KH2PO41 g/L，MgSO40.5 g/L，riboflavin 0.5 mg/L.Under the optimum medium，cell yield of polysaccharide was up to 4.23%，which was increased by 1.06 times of previous optimization.The study could provide a theory reference for the mass production in the future.

response surface methodology；Cordyceps sinensis；polysaccharide；medium optimization

S816.7

A

1004-3314（2016）13-0009-05

10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20161302