复合酶辅助高压法提取金针菇黄酮的工艺优化

王广慧

（黑龙江省绥化学院食品与制药工程学院，黑龙江绥化152061）

检测分析

复合酶辅助高压法提取金针菇黄酮的工艺优化

王广慧

（黑龙江省绥化学院食品与制药工程学院，黑龙江绥化152061）

为研究复合酶辅助高压法提取金针菇黄酮的最适条件，本试验通过单因素试验和正交试验，对固液比、酶反应时间、酶反应温度、酶反应pH、高压时间及高压温度对黄酮得率的影响进行了研究，并以金针菇黄酮得率为评价指标，优化提取工艺。试验结果表明，复合酶辅助高压法提取金针菇黄酮的最优条件是：固液比为1∶35（g/mL），酶反应时间为80 min，酶反应温度为50℃，酶反应pH为6，高压处理温度为115℃，高压处理时间为40 min。以上述条件从金针菇中提取黄酮，得率可达13.45%。

金针菇；黄酮；复合酶；高压；提取

金针菇［Flammulinavelutiper（Fr.）Sing］中富含多种营养物质，其中的黄酮类化合物具有消除疲劳、保护心脑血管、预防动脉硬化、疏通微循环、抗衰老以及活化大脑和其他脏器细胞的功效，且毒副作用很小（侯波等，2013；方玉梅等，2012a、b），既可作为保健食品，也可开发为动物饲料添加剂。目前关于金针菇黄酮提取工艺研究的报道很多，但普遍存在提取率低的缺点。本试验采用复合酶辅助高压法从金针菇中提取黄酮，其中的高压提取技术是本课题组研发出来的有效提取食用菌中生物活性物质的方法，目前已成功用于黑木耳多糖、香菇多糖及金针菇中总黄酮的提取（王广慧等，2015、2013）。复合酶辅助高压法集复合酶提取法和高压提取法的优点于一体，为开发金针菇黄酮提供了重要参考。

1　材料与仪器

1.1材料与试剂金针菇由绥化学院微生物实验室培养所得；木瓜蛋白酶和纤维素酶购于北京奥博星生物技术有限公司；试验所用硝酸铝、亚硝酸钠等化学试剂均为国产分析纯。

1.2主要仪器TDL-5A型离心机：金坛市新航仪器厂；JK-G-500B2型高速粉碎机：上海精科仪器公司；752型分光光度计：上海光学仪器厂；BL-50A型立式压力蒸汽灭菌器：上海博讯实业有限公司；DK-98-ⅡA型电热恒温水浴锅：上海衡平仪器仪表厂。

2　方法

2.1检测方法线性回归方程的获取：以芦丁标准品为对照，先加入5%的NaNO2溶液，再加入10%的Al（NO3）3溶液，最后加入4%的NaOH溶液（王广慧等，2015）。在碱性条件下，黄酮类物质可与铝盐相络合。此络合物在510 nm处表现出特征性的光吸收峰，其吸光值与黄酮的浓度呈正相关。

2.2复合酶辅助高压法提取金针菇黄酮的具体操作方法将金针菇中的杂质清除干净，置于50℃烘箱中干燥至恒重，用高速粉碎机将其制成干粉并过80目筛。称取每份为3.0 g的金针菇粉若干份，放于烧杯中，按试验设计要求加入磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液和复合酶（木瓜蛋白酶和纤维素酶按质量比1∶1混合），在恒温水浴锅中进行酶解反应，然后置于立式压力蒸汽灭菌器中浸提。将提取液离心后所获上清蒸发浓缩后用3倍体积的95%乙醇于4℃冰箱中沉淀过夜。沉淀中的多糖等杂质可通过离心清除。按照2.1法测出提取液中黄酮含量并计算出黄酮得率。重复3次。

2.3试验设计方案

2.3.1单因素试验方案

2.3.1.1固液比影响的试验设计分别在5份金针菇粉中加入样品量1.00%的复合酶，并按照固液比1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40（g/mL）加入pH=5的缓冲液，在50℃下酶解80 min后再在108℃下高压提取40 min。

2.3.1.2酶反应时间影响的试验设计在最佳固液比、酶添加量为1.00%、酶解温度为50℃，反应pH为5的条件下，设定酶反应时间分别为50、60、70、80n、90 min，然后在108℃下高压热水浸提40 min，提取后测定黄酮得率。

2.3.1.3酶反应温度影响的试验设计在最佳固液比、最佳酶反应时间、酶添加量为1.00%、反应pH为5的条件下，分别设置酶反应温度为30、40、50、60、70℃，然后在108℃下高压热水浸提40 min，提取后测定黄酮得率。

2.3.1.4酶反应pH影响的试验设计在固液比、酶反应时间及酶反应温度都取最佳值，酶添加量为1.00%的条件下，调节酶促反应pH，分别设为3、4、5、6、7，然后在108℃下高压热水浸提40 min，提取后测定黄酮得率。

2.3.1.5高压温度影响的试验设计在上述四个影响因素都处于最佳值的情况下，将金针菇粉的高压浸提温度分别设为75、90、108、115、121℃，高压处理时间设为40 min，提取后测定黄酮得率。

2.3.1.6高压时间影响的试验设计在以上影响因素都取最佳值的条件下，将金针菇粉分别按照高压时间30、40、50、60、70 min进行处理并测定黄酮得率。

2.3.2正交试验方案基于单因素试验数据，选取对金针菇黄酮得率影响较大的因素和水平进行正交试验设计，以优化出提取金针菇黄酮的最适条件。

3　结果与分析

3.1线性回归方程的获取按照2.1所述方法进行试验操作，得到线性回归方程为：y=0.3759x+ 0.0196，R2=0.9979，式中：y为光吸收值，x为芦丁（黄酮）含量，mg/mL。

3.2复合酶辅助高压法提取金针菇黄酮的试验结果

3.2.1单因素试验结果

3.2.1.1固液比影响的试验结果由图1可知，黄酮得率在固液比为1∶35（g/mL）时达到最高点，为11.78%，可见太高或太低的固液比都不宜于黄酮的溶出，而且过高的固液比还会增加后续浓缩试验的难度，所以选择1∶35为金针菇黄酮提取的最佳固液比。

图1　固液比对金针菇黄酮得率的影响

3.2.1.2酶反应时间影响的试验结果在最佳固液比为1∶35（g/mL）的条件下，改变酶反应时间，得到的黄酮得率数据结果见图2。

图2　酶反应时间对金针菇黄酮得率的影响

由图2可知，80 min酶反应时间时金针菇黄酮的得率最高，为11.78%，因此最佳酶反应时间是80 min。分析其原因可能是酶反应时间太短时酶解不彻底，而酶解时间过长又会使酶变性失活，所以两种情况下都不利于金针菇细胞中黄酮物质的溶出，导致黄酮得率降低。

3.2.1.3酶反应温度影响的试验结果按照最佳料液比1∶35加缓冲液、酶解时间为80 min，在此条件下，改变酶反应温度，所得黄酮得率如图3所示。

图3　酶反应温度对金针菇黄酮得率的影响

由图3可知，酶反应温度在50℃时金针菇黄酮的得率最高，为11.78%，因此最佳酶反应温度是50℃。分析原因可能是，温度过低时酶活也低，而温度过高又会导致酶变性失活。

3.2.1.4酶反应pH影响的试验结果在固液比、酶反应时间及酶反应温度都取最佳值的条件下，调节酶促反应pH，所得黄酮得率如图4所示。

图4　酶反应pH对金针菇黄酮得率的影响

由图4可知，pH为6的反应条件下可得到12.91%的黄酮得率，为最高，因此最佳酶反应pH为6。分析原因可能是pH值过高或过低都会影响到酶和底物可解离基团的解离，从而影响到酶促反应的速率。

3.2.1.5高压温度影响的试验结果在上述四个影响因素都取最佳值的情况下，改变高压热水浸提温度，所得黄酮得率如图5所示。

图5　高压浸提温度对金针菇黄酮得率的影响

由图5可知，高压处理温度为115℃时黄酮得率最高，为13.45%。分析其原因可能是高压浸提温度过低时金针菇细胞没有完全被解体，黄酮类物质不能与溶媒充分接触而不利于其释放，而高压浸提温度过高则会破坏活性黄酮的分子结构，从而降低其得率。

3.2.1.6高压时间影响的试验结果在以上影响因素都取最佳值的条件下，改变高压浸提时间，得到的数据结果见图6。

图6　高压浸提时间对金针菇黄酮得率的影响

由图6可知，高压浸提时间为40 min时黄酮的得率13.45%为最高，因此选择40 min为最适的高压处理时间。分析原因可能是高压时间太短会导致金针菇细胞不能完全被破坏，从而使黄酮类物质释放不完全，而高压时间太长则会破坏黄酮的结构，降低活性黄酮的得率。

3.2.2正交试验结果基于单因素试验所得数据设计L9（34）正交试验，设计方案见表1，其中固液比固定为1∶35（g/mL），酶添加量固定为1.00%，酶反应时间固定为80 min。正交试验结果见表2。

表1　L9（34）正交试验因素与水平

表2　正交试验结果

由表2可知，各因素对黄酮得率的影响大小顺序依次为A（酶反应温度）＞C（高压温度）＞B（酶反应pH）＞D（高压时间），由此确定提取金针菇黄酮的最优条件为A2C2B2D2，即：酶反应温度为50℃，高压处理温度为115℃，酶反应pH为6，高压处理时间为40 min。在此条件下做验证试验，得到金针菇总黄酮得率为13.45%。

4　结论

本试验通过单因素试验和正交试验对复合酶辅助高压法提取金针菇黄酮的工艺进行了优化研究。研究结果显示，此法对金针菇黄酮的提取效果较好，得率较高。分析其原因可能是：一方面，通过复合酶的酶解过程强化了传质过程，增加了黄酮的得率（王芸芸等，2008）；另一方面，高温高压作用能使细胞解体，使被提取物质充分溶出（王广慧等，2015）。由本试验结果可知，复合酶辅助高压法提取金针菇黄酮的最适条件是：固液比为1∶35（g/mL），酶反应时间为80 min，酶反应温度为50℃，酶反应pH为6，高压处理温度为115℃，高压处理时间为40 min。以上述条件从金针菇中提取黄酮，得率可达13.45%。

［1］方玉梅，谭萍，王毅红，等.金针菇黄酮类化合物清除DPPH自由基活性［J］.食品研究与开发，2012，33（7）：8～10.

［2］方玉梅，张春生，谭萍，等.金针菇黄酮类化合物的抗氧化性作用［J］.食品研究与开发，2012，33（3）：15～18.

［3］侯波，郑淑彦，邰丽梅，等.金针菇营养保健功能及食品加工研究现状［J］.食品研究与开发，2013，34（12）：122～126.

［4］王广慧，戴明，魏雅冬.香菇多糖的提取工艺研究［J］.食品科技，2013，38（1）：192～194.

［5］王广慧，魏雅冬，于德涵.高压热水浸提法提取金针菇黄酮的优化研究［J］.食品科技，2015，40（3）：241～244.

［6］王芸芸，李莉，李香玉，等.复合酶法提取甘草渣中总黄酮［J］.化学与生物工程，2008，25（8）：49～51.

In this study，a composite enzyme assisted with high pressure extraction method was developed for the extraction of flavonoids from Flammulina velutiper.The extraction conditions were optimized through the single factor and orthogonal tests.The effects of solid-liquid ratio，enzymatic reaction time，enzymatic reaction temperature，enzymatic reaction pH，high-pressure extraction time and high-pressure extraction temperature on the extraction yield of flavonoids were investigated.The experimental results showed that the optimal condition was solid-liquid ratio of 1∶35（g/mL），enzymatic reaction time of 80 min，enzymatic reaction temperature of 50℃，enzymatic reaction pH of 6，high-pressure extraction temperature of 115℃and hig-pressure extraction time of 40 min.Under these conditions，the extraction yield of flavonoids from Flammulina velutipe was up to 13.45%.

Flammulina velutiper（Fr.）Sing；flavonoids；composite enzyme；high-pressure；extraction

水产养殖

S816.7

A

1004-3314（2016）13-0025-03

10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20161306

国家自然科学基金（21201128）；绥化学院科研创新团队资助项目