用石蜡切片行C3d、C4d免疫组化染色辅助诊断大疱性类天疱疮的意义

张洁尘 杨永红 李志量 冯素英

·论著·

用石蜡切片行C3d、C4d免疫组化染色辅助诊断大疱性类天疱疮的意义

张洁尘 杨永红 李志量 冯素英

目的 探讨C3d、C4d免疫组化染色在石蜡包埋组织切片中辅助诊断大疱性类天疱疮的价值。方法 通过免疫组织化学SP法检测20例大疱性类天疱疮患者石蜡包埋组织切片中C3d、C4d的表达，并与家族性良性天疱疮、大疱性表皮松解症患者及正常皮肤进行对照。结果 20例大疱性类天疱疮患者石蜡包埋切片C3d、C4d真表皮交界基底膜处沉积率为95%（19/20），9例大疱性表皮松解症患者中真表皮交界基底膜处C3d、C4d阳性率0%（0/9），4例家族性慢性良性天疱疮患者基底膜带均为阴性。结论石蜡包埋组织切片中，C3d、C4d免疫组化染色可以作为辅助诊断大疱性类天疱疮的方法之一。

类天疱疮，大疱性；石蜡包埋；显微切片术；免疫组织化学；补体C3d；补体C4d

大疱性类天疱疮（BP）是以自身抗体及补体在皮肤基底膜带沉积为主要特征的自身免疫性大疱病。自身免疫抗体针对半桥粒复合物蛋白BP180、BP230，而半桥粒是将角质形成细胞基底锚定到其下方基底膜的结构。目前研究认为，补体激活途径参与其发病机制中，而补体可通过直接免疫荧光（DIF）检测。免疫荧光技术建立以来，BP是首先应用该技术检测的疾病之一［1］。然而，由于DIF检测需要新鲜冰冻组织，临床不易开展，对于组织病理怀疑BP，而临床遗漏行DIF检测的患者，常需要重复取材，增加了患者的负担。因此，我们对石蜡包埋组织切片行组织化学染色是一种可行的补救措施。补体系统的经典激活途径及替代激活途径参与了BP的发病［2］。激活的补体降解产物C3d、C4d已被证明是体液性排斥的重要标志，已应用于肾移植体液免疫排斥反应的检测［3］，其沉积与排斥严重程度以及预后密切相关。近期研究显示，C3d及C4d免疫组化在石蜡包埋皮肤活检组织标本中，具有诊断炎症性皮肤病的作用，包括BP的诊断［4］。现将我们的研究报道如下。

1 对象与方法

1.1 对象：2011—2014年，中国医学科学院皮肤病医院确诊为BP的患者20例，其中女7例，男13例，年龄58～90岁。对照组9例为先天性大疱性表皮松解症（EB）患者，女4例，男5例。年龄7～57岁；家族性良性天疱疮患者（HH）4例，其中女2例，男2例，年龄45～58岁，健康对照4例，均来自本院外科整形美容手术切除新鲜健康人皮肤组织。根据病史、临床表现、组织病理检查、免疫荧光检查、酶联免疫吸附测定或盐裂皮肤间接免疫荧光实验检查确诊。

作者单位：210042南京，中国医学科学院 北京协和医学院 皮肤病医院 江苏省皮肤病与性病学重点实验室皮肤科（第二作者现在济宁医学院科研处）

1.2 方法：

1.2.1 主要试剂：兔抗人C3d多克隆抗体，兔抗人C4d多克隆抗体（ab136916，美国Abcam公司），免疫组化试剂盒（SP9706，UltraSensitive TM S-P 超敏试剂盒，福州迈新生物技术开发有限公司），DAB试剂盒（福州迈新生物技术开发有限公司）。

1.2.2 方法：免疫组化SP法，将石蜡包埋组织切片（厚度4.5 μm），常规脱蜡水化，微波抗原修复然后用过氧化氢酶抑制剂作用10 min灭活内源性过氧化物酶，加正常山羊血清封闭液，室温孵育10 min；滴加一抗，4℃过夜（设空白对照与阳性对照）C3d抗体1∶300稀释，C4d抗体1∶200稀释，加HRP标记的二抗，室温静置15 min，DAB显色5～10 min，苏木精复染2 min，盐酸乙醇分化，脱水、透明，中性树脂胶封片。

1.2.3 免疫组化结果判定：3名研究人员分别盲判，7 d后重复判定。两次均判定为阳性的标记为阳性。阳性结果定义为C3d、C4d在基底膜处呈线性沉积。阴性结果为C3d、C4d仅在水疱腔、水疱顶部或底部沉积，而无皮损周边皮肤的基底膜沉积。

1.3 结果：

1.3.1 BP组：20例BP患者中19例出现C3d、C4d在水疱周围基底膜线状沉积。20例组化切片中出现水疱的17例，13例疱顶可见C3d、C4d线状沉积，15例疱底可见C3d、C4d线状沉积；其中在水疱顶部及底部均有沉积，而水疱周边基底膜无C3d、C4d沉积的1例；仅在疱顶C3d、C4d沉积的1例，无C3d、C4d沉积在疱底的患者（图1）。

1.3.2 对照组：EB患者9例，HH患者4例以及健康对照的4例皮肤均未见基底膜线状沉积（图2，3）。

2 讨论

Magro 等［4］将 C3d、C4d 石蜡包埋组织免疫组化应用于炎症皮肤病的辅助诊断，包括胶原血管疾病（红斑狼疮、皮肌炎）、血管病变（卟啉病、血管栓塞综合征、脉管栓塞综合征、坏死性血管炎）、自身免疫性疱病（天疱疮、BP）。Chandler等［5］使用 C4d 石蜡包埋组织免疫组化染色用于BP的辅助诊断，结果9例BP和（或）获得性EB患者有7例基底膜带可见特征性线状沉积。Pfaltz等［6］用类似方法研究 C3d，结果显示，97%（31/32例）的BP患者C3d基底膜线状沉积。郭坤和耿松梅［7］报道，有 96%（24/25例）BP患者石蜡包埋组织C3d染色阳性。

本研究将C3d、C4d共同应用于BP石蜡包埋切片免疫组化研究，选择3名研究人员独立盲判且7 d后重复判定，两次均判定为阳性的标记为阳性，3名研究人员判定结果均一致。本文结果显示，已确诊的BP患者石蜡包埋切片的C3d、C4d阳性在基底膜沉积率均达95%（19/20例），与上述研究结果类似。而且C4d的结果普遍清晰度均优于C3d，这与Magro等［4］报道的结果一致。本文研究中选择EB及HH患者和健康人做为阴性对照。EB是以真皮或基底膜水疱为特征的遗传性疾病，其水疱位置虽然位于基底层下方，但水疱形成是由于物理原因导致的真表皮分离。本研究选取确诊的9例EB患者中均无C3d、C4d皮肤基底膜带线状沉积，其中在水疱顶部及底部均有沉积，而水疱周边基底膜无C3d、C4d沉积的1例；仅在疱顶C3d、C4d沉积的1例，没有C3d、C4d仅沉积在疱底患者。Chandler等［5］报道的研究中，分析了疱底沉积现象，该研究基底膜具有线状C4d沉积的70%患者（7/10例）中，有3例具有疱底沉积仅有1例是做过盐裂皮肤间接免疫荧光被证实为获得性大疱性表皮松解症患者，作者推测，C4d沉积可能反应了抗体沉积位置，BP位于上方透明板层，而获得性大疱性表皮松解症则位于下方的致密板层。在本研究中，EB也可出现疱顶疱底沉积现象，具有水疱改变的17例BP患者石蜡包埋组织切片中，既有疱顶沉积又有疱底沉积，且未发现规律性。因此，我们认为，疱顶与疱底沉积不具有特异性。水疱周围的基底膜出现线状沉积具有诊断价值，这与Pfaltz等［6］及郭坤和耿松梅［7］的判定方法相一致。

综上所述，虽然冰冻切片免疫荧光染色诊断BP具有操作步骤简单、组织抗原保存良好、特异性强、敏感度高等特点。但冰冻切片保存时间较短，需要及时完成免疫荧光染色检测，若外院转送新鲜标本时间过长，高温可能导致组织自溶，影响结果判断；而且冰冻切片机很大程度上限制了该技术的广泛应用。我们研究结果表明，石蜡包埋组织切片的C3d、C4d染色在水疱周边组织真表皮连接处的基底膜区域出现线状沉积是一种临床辅助诊断方法，具有较高阳性率。

［1］ Gately LE,Nesbitt LT.Update on immunofluorescent testing in bullous diseases and lupus erythematosus ［J］.Dermatol Clin,1994,12（1）:133-142.

［2］ Nelson KC,Zhao M,Schroeder PR,et al.Role of different pathways of the complement cascade in experimental bullous pemphigoid［J］.J Clin Invest,2006,116（11）:2892-2900.

［3］ Feucht HE,Schneeberger H,Hillebrand G,et al.Capillary deposition of C4d complement fragment and early renal graft loss［J］.Kidney Int,1993,43（6）:1333-1338.

［4］ Magro CM,Dyrsen ME.The use ofC3d and C4d immunohistochemistry on formalin-fixed tissue as a diagnostic adjunct in the assessment of inflammatory skin disease ［J］.J Am Acad Dermatol,2008,59 （5）:822-833.DOI:10.1016/j.jaad.2008.06.022.

［5］ Chandler W,Zone J,Florell S.C4d immunohistochemical stain is a sensitive method to confirm immunoreactant deposition in formalin-fixed paraffin-embedded tissue in bullous pemphigoid［J］.J Cutan Pathol,2009,36（6）:655-659.DOI:10.1111/j.1600-0560.2008.01129.x.

［6］ Pfaltz K,Mertz K,Rose C,et al.C3d immunohistochemistry on formalin-fixed tissue is a valuable tool in the diagnosis of bullous pemphigoid of the skin ［J］.J Cutan Pathol,2010,37（6）:654-658.DOI:10.1111/j.1600-0560.2009.01450.x.

［7］郭坤,耿松梅.C3d在大疱性类天疱疮患者皮损组织中的表达［J］.中华皮肤科杂志,2012,45（5）:364-365.DOI:10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2012.05.024.

Diagnostic value of immunohistochemical staining for C3d and C4d in paraffin sections in bullous pemphigoid

Zhang Jiechen,Yang Yonghong,Li Zhiliang,Feng Suying.Department of Dermatology,Hospital of Dermatology,Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College;Jiangsu Key Laboratory of Molecular Biology for Skin Diseases and STIs,Nanjing 210042,China

ObjectiveTo estimate the value of immunohistochemical staining for C3d and C4d in paraffin-embedded tissue sections for the auxiliary diagnosis of bullous pemphigoid （BP）.MethodsParaffinembedded tissue sections from 20 patients with BP served as the experiment group,and those from lesions of 9 patients with familial benign pemphigus and 4 patients with epidermolysis bullosa as well as from normal skin served as the controls.Immunohistochemical SP method was used to measure the expressions of C3d and C4d in these paraffin sections.ResultsThe deposition of C3d and C4d was observed in the basement membrane at the dermo-epidermal junction in 95% （19/20） of BP tissue sections,but undetected in any of the familial benign pemphigus or epidermolysis bullosa tissue sections.ConclusionImmunohistochemical staining for C3d and C4d in paraffin-embedded tissue sections may serve as an auxiliary method for the diagnosis of BP.

Pemphigoid, bullous; Paraffin embedding; Microtomy; Immunohistochemistry;Complement C3d;Complement C4d

Feng Suying,Email:fengsuying@medmail.com.cn

2015-04-09）

北京协和医学院协和青年基金（2012J07）

Fund program:Union Youth Foundation of Peking Union Medical College(2012J07）

10.3760/cma.j.issn.1673-4173.2016.01.001

冯素英，Email:fengsuying@medmail.com.cn