反常性痤疮一家系nicastrin基因突变研究

肖学敏 徐浩翔 惠云 张晓峰 何艳艳 李诚让 王宝玺

·论著·

反常性痤疮一家系nicastrin基因突变研究

肖学敏 徐浩翔 惠云 张晓峰 何艳艳 李诚让 王宝玺

目的 研究一家系2例汉族反常性痤疮患者γ分泌酶基因的突变。方法 提取家系中5名成员（2例患者、先证者父亲、2例目前未发病者）的外周血DNA，扩增nicastrin蛋白（NCSTN）、早老素（PSEN）1、早老素增强子（PSENEN）、前咽缺陷蛋白（APH1）基因所有外显子和侧翼序列进行测序，并以100例无关系健康人作为对照。同时比较先证者皮损与4个健康对照NCSTN基因mRNA表达差异。结果 检测到2例患者血样DNA存在NCSTN基因中第477位碱基发生C→A的杂合突变，即c.477C＞A，其余3名家系成员及健康对照未发现相应突变；查询美国国家生物技术信息中心网站单核苷酸多态性数据库也未发现此突变。另外，先证者皮损NCSTN mRNA水平较健康对照明显减少。结论 NCSTN基因新的无义突变c.477C＞A是该反常性痤疮家系的致病突变，并可能通过无义介导的mRNA降解途径导致该基因功能失活。

反常性痤疮；基因；突变；系谱；基因，nicastrin

作者单位：350001福州，福建医科大学附属协和医院皮肤科（肖学敏）；中国医学科学院 北京协和医学院 皮肤病医院 江苏省皮肤病与性病分子生物学重点实验室皮肤科（徐浩翔、张晓峰、何艳艳、李诚让）；南京总医院皮肤科（惠云）；中国医学科学院北京协和医学院整形外科医院皮肤科（王宝玺）

反常性痤疮（OMIM142690）又称化脓性汗腺炎、毛囊闭锁三联征，是一种慢性复发性炎症性疾病。2010年，Wang等［1］通过全基因组连锁扫描结合单倍型分析等技术，首先发现编码γ分泌酶不同亚单位的基因突变可引起部分家族性反常性痤疮。γ分泌酶是一种跨膜蛋白酶，包含4个必要组分，分别为：早老素（presenilin，PSEN）、nicastrin 蛋白（NCSTN）、前咽缺陷蛋白（anterior pharynxdefective-1，APH1）、早老素增强子（presenilinenhancer-2，PSENEN）［2］。我们报道1个汉族反常性痤疮家系，并对其进行了γ分泌酶基因突变检测。

1 资料和方法

1.1 临床资料：我们鉴定了1个3代12人中国汉族反常性痤疮家系，家系中有5例患者（男2例，女3例），遗传方式属于常染色体显性遗传（图1）。先证者男，24岁，汉族，7年前无明显诱因出现后颈、背部黑头粉刺、丘疹、脓疱、结节，自觉疼痛，皮损渐增多，并累及头面部、双侧腋窝、腘窝、双上肢，病情逐渐加重形成多处囊肿、脓肿、破溃，于当地医院行清创、口服米诺环素、异维A酸等治疗尚可控制，但反复有新疹出现，皮疹愈后留有大量萎缩性不规则形瘢痕。3年前在臀部出现类似改变，不断出现新发囊肿、脓肿，部分相互融合形成窦道，呈筛孔状，有血性脓液溢出（图2）。既往体健，有吸烟史7年，约每天10支。家系中其余4例患者有类似症状均在青春期发病，症状比先证者轻微，皮损主要累及颈后、背部及臀部，其母亲皮损见图3。家系中所有患者均符合反常性痤疮的诊断标准［3］。

图1 家系图

1.2 方法：

1.2.1 外周血及皮损DNA的提取：获得知情同意后，抽取该家系中2例患者即先证者（Ⅲ1）与其母亲（Ⅱ1）、先证者父亲（Ⅱ2）、2例目前未发病者（Ⅲ2、Ⅲ3）及与该家系无关的100例健康人外周血2 ml。采用美国Promega公司DNA提取试剂盒提取基因组DNA。同时提取100例与家系无血缘关系的健康成人的基因组DNA作为对照。本研究经中国医学科学院皮肤病医院医学伦理委员会批准。

1.2.2 PCR扩增和直接测序：根据已知γ分泌酶基因四亚基各亚型基因序列［1］，对其所有外显子及侧翼内含子序列使用在线Primer 5.0程序设计出对应的引物。PCR反应体系50 μl，反应液成分包括25 μl Mix，上下游引物各 1 μl，DNA 模板 1 μl，加入ddH2O补足至50 μl。PCR反应条件为95℃预变性 3 min、95℃变性 30 s、56℃ ～63℃退火 45 s、72℃延伸45 s、41个循环；41个循环后再72℃延伸5min。2%琼脂糖凝胶电泳检查PCR产物。PCR扩增的目的片段经回收、PCR纯化试剂盒（德国Qiagen公司）纯化、ABI3730自动测序仪（美国Applied Biosystems公司）进行核苷酸序列测定。测序结果与人基因组γ分泌酶基因序列比较，使用Phred-Phrap-Consed软件包（version 12.0）进行分析，如存在异常再进行反向测序。

图2 先证者颈后部（2A）及臀部（2B）广泛的囊肿、脓肿、窦道、瘢痕

图3 先证者母亲颈后部表现为相对较轻的反常性痤疮

1.2.3 实时PCR法测定皮损中NCSTN基因mRNA水平的表达：在中国医学科学院皮肤病医院皮肤外科取先证者臀部皮损及4例与该家系无关的健康对照相同部位皮肤，尽量切除皮下组织。生理氯化钠溶液清洗皮肤，吸干，置-80℃冰箱保存。取50～100mg冰冻皮肤组织，于低温下快速粉碎，用Trizol核酸抽提试剂（美国Invitrogen公司）提取总RNA；按照反转录试剂盒（日本Takara公司）说明合成cDNA，再用该公司DNA扩增试剂盒，根据说明进行PCR反应。使用在线Primer 5.0程序设计出对应的引物，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。NCSTN上游引物为 5′-AATGTGAGCTATCCCAATG-3′，下游引物为5′-GCGATGTAATGTTGAAGAGGC-3′；β肌动蛋白上游引物为5′-CCATCGTCCACCGAA AT-3′，下游引物为5′-GCTGTCACCTTCACCGTT CC-3′。PCR反应体系置于ABI 7300 Real Time PCR仪（美国Applied Biosystems公司）进行实时荧光定量PCR反应。反应条件为95℃预变性5min、95℃变性30 s、58℃退火30 s、72℃延伸 30 s，共40个循环；40个循环后再72℃延伸 5 min。采用 2-△△CT法对实时定量PCR实验结果进行数据分析，△CT值表示循环数，β肌动蛋白作为内参照。△△CT（目的基因）=△CT（目的基因）-△CT（β肌动蛋白），目的基因的相对表达量=2-△△CT。阴性对照加双蒸水作为模板，重复3次，数据以±s表示。

2 结果

我们对2例患者血样NCSTN基因第5对引物的PCR产物测序后发现，患者NCSTN基因第5号外显子含有杂合性无义突变：第477位碱基胞嘧啶突变为鸟嘌呤，即c.477C＞A，对应密码子TGC变成TGA，导致第159位的中性半胱氨酸残基被终止密码子替代，即p.C159X（NCSTN GenBank NM_015331.2和NP_056146.1），导致NCSTN前体蛋白缺失了551个氨基酸。先证者父亲、家系中2例目前未发病者以及100例健康对照均未发现有此突变（图4）。为探讨该突变对NCSTN mRNA的影响，对先证者皮损和4例健康对照用实时定量PCR法检测NCSTNmRNA水平的表达，可见先证者皮损NCSTNmRNA水平较健康对照明显减少（图5）。

3 讨论

反常性痤疮多发于腋窝、腹股沟、肛周、会阴和乳房下等皱褶部位；临床表现为痛性皮下结节和脓肿，常伴皮肤附属器破坏、窦道和瘢痕形成。约40%的患者有家族史，属常染色体显性遗传［2］。目前已在反常性痤疮患者的γ分泌酶基因上发现了27个不同的突变位点，其中发生在NCSTN基因上的有22 个，均为功能缺失性突变［4-5］。由此可见，NCSTN亚基改变在反常性痤疮发病过程中有着重要作用。NCSTN属于Ⅰ型跨膜糖蛋白，由一个胞外域和一个C末端TM组成，参与γ分泌酶的组装、成熟及稳定，最近发现还具有募集γ分泌酶底物的功能［6-7］。

本研究中，我们在1个反常性痤疮家系中发现先证者及其母亲第5号外显子含有杂合性无义突变c.477C＞A。先证者父亲、家系中2例目前未发病者以及正常对照均未发现有此突变，查询美国国家生物技术信息中心网站单核苷酸多态性数据库也未发现此突变，从而证实了检测到的突变是特异性的突变，非核苷酸多态性。先证者皮损NCSTN mRNA水平较健康对照明显减少，说明该突变可通过“无义介导的mRNA降解（nonsense-mediatedmRNA decay）”途径导致基因转录本表达缺失，可能使基因编码的蛋白质失去原有的功能，因此，该基因突变属于功能缺失性突变。另外，本研究发现的无义突变与既往报道的4个无义突变均位于NCSTN亚基的胞外域，进一步证实了胞外域在γ分泌酶复合体的功能及反常性痤疮的发病机制中可能发挥关键作用［8］。同时，我们通过基因库检索该突变的相对蛋白位置，发现在所有真兽亚纲物种中Cys159属于保守氨基酸残基，此位置在长期进化过程中未被其他氨基酸替代，表明其对保持蛋白活性发挥重要作用。

图4 NCSTN基因测序结果 4A：先证者血样NCSTN基因第477位碱基（箭头）显示1个杂合性突变，1条染色单体上的C转换为A；4B：家系内健康人NCSTN基因对应序列无突变

图5 实时荧光定量PCR NCSTN 先证者皮损NCSTN mRNA水平较健康对照明显减少

NCSTN基因突变在反常性痤疮发病中的机制尚不清楚。有学者发现，NCSTN基因缺陷的小鼠会出现毛囊角化过度、表皮囊肿形成等类似人类反常性痤疮的表现，而小鼠缺乏顶泌汗腺，提示毛囊栓塞为反常性痤疮的初始及最主要的致病因素［9］。γ分泌酶的底物中，Notch分子与表皮细胞分化增殖、毛囊终末分化密切相关，Notch基因失活的小鼠也出现了类似人类反常性痤疮的表型［10］。因此，NCSTN基因功能缺失性突变通过导致γ分泌酶-Notch信号通路受损，进而诱发毛囊漏斗部异常角化及栓塞形成可能在本病发病中起关键作用。值得一提的是，本家系中先证者较家系中其他患者症状要重，这可能与该患者有较长的吸烟史有关，而其他患者无吸烟史。已有研究证实，吸烟是反常性痤疮发病的重要危险因素之一，吸烟可能进一步损害已经存在缺陷的 Notch信号通路，导致病情加重［5］。

综上所述，本研究在一个汉族反常性痤疮家系中发现了1个新的NCSTN基因的无义突变c.477C＞A，扩大了反常性痤疮致病基因的突变谱，皮损中NCSTN表达降低为NCSTN基因功能缺失性突变导致单倍剂量不足是反常性痤疮发病的分子基础这一观点提供了证据，也为后续探讨反常性痤疮基因型和表型之间的相关性、阐明反常性痤疮发病机制奠定基础。

［1］ Wang B,Yang W,Wen W,et al.Gamma-secretase gene mutations in familial acne inversa ［J］.Science,2010,330（6007）:1065.DOI:10.1126/science.1196284.

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Mutation analysis of the nicastrin gene in a Chinese pedigree with acne inversa

Xiao Xuemin*,Xu Haoxiang,Hui Yun,Zhang Xiaofeng,He Yanyan,Li Chengrang,Wang Baoxi.*Department of Dermatology,Union Hospital,Fujian Medical University,Fuzhou 350001,China

Objective To identify mutations of the γ-secretase gene in two patients with acne inversa（AI） in a Chinese pedigree.Methods Blood samples were obtained from 5 family members （including 2 patients,the proband′s father,2 unaffected family members） and 100 unrelated healthy controls.Genomic DNA was extracted from these blood samples,and PCR was conducted to amplify all the exons and their flanking sequences of nicastrin （NCSTN）,presenilin-1 （PSEN1）,presenilin enhancer（PSENEN） and anterior pharynx-defective 1 （APH1） genes,followed by direct sequencing.Besides,the NCSTN mRNA expression in skin lesions of the proband was compared with that in the normal skin of 4 healthy controls.Results A heterozygous mutation （c.477C ＞ A） at position 477 in the exon 5 of the NCSTN gene,which had not been described previously in the National Center for Biotechnology Information （NCBI） single nucleotide polymorphism database,was identified in the 2 patients,but not observed in the other 3 unaffected family members or the 100 unrelated controls.Additionally,the mRNA expression of NCSTN was evidently decreased in the lesions of the proband compared with the normal skin of healthy controls.Conclusion The novel nonsense mutation c.477C＞ A in the NCSTN gene is the causative mutation of AI in this family,and it may induce functional inactivation of NCSTN through the nonsense-mediated mRNA decay.

Acne inversa;Genes;Mutation;Pedigree;Genes,nicastrin

s:Li Chengrang,Email:nylcr72@163.com;Wang Baoxi,Email:wangbx@ncstdlc.org

国家自然科学基金（81472905，81472872）；北京协和医学院协和青年基金（3332013056）

Fund programs:National Natural Science Foundation of China （81472905,81472872）;PUMC Youth Fund （3332013056）

10.3760/cma.j.issn.1673-4173.2016.04.001

李诚让，Email:nylcr72@163.com;王宝玺，Email:wangbx@ncstdlc.org

2015-07-06）