重度烧伤创面免疫细胞变化与临床意义

李鸿明，周金武，毛高才，陈建设，沈光裕(中国人民解放军第87医院烧伤整形科、病理科，海南海口57006)

·论著·

重度烧伤创面免疫细胞变化与临床意义

李鸿明1，周金武1，毛高才2，陈建设1，沈光裕1
(中国人民解放军第187医院烧伤整形科1、病理科2，海南海口570206)

目的观察烧伤患者的白细胞亚群随时间的变化，并探讨其与烧伤严重程度的关系。方法选取我院2013年11月至2014年12月收治的22例中重度烧伤患者，分别于烧伤后3 d、1周、2周、3周从深Ⅱ度烧伤的创面提取标本。采用组织化学和免疫组织化学法，使用白细胞抗体，检测中重度烧伤患者移行区(坏死与存活组织交界区域)伤后不同时间点白细胞亚群的变化。结果中度烧伤组在伤后3 d移行区可见到白细胞浸润，2～3周后见到大量白细胞浸润，早期多形核白细胞(PMN)多见，晚期单核细胞(MNC)多见；重度烧伤组早期移行区鲜有白细胞，晚期可见少量PMN。伤后2周中度烧伤组移行区T细胞、Th细胞、Tc细胞均多于重度烧伤组，差异有统计学意义(P＜0.05)，B细胞数量两组相似，差异无统计学意义(P＞0.05)，中度烧伤组鲜见IL-2Rα+细胞，重度烧伤组未见到IL-2Rα+细胞。结论烧伤后白细胞浸润、烧伤严重程度和时间密切相关，反映了受伤区域抗感染能力和免疫排斥能力的改变，为合理治疗和延长移植皮肤的寿命提供了理论依据。

白细胞；烧伤；感染；免疫组化

创面是烧伤后是最容易受感染的部位，尤其是深度烧伤的患者，感染是引起重度烧伤患者死亡的重要原因。这是因为重度烧伤患者体内免疫系统处理抑制状态，一旦合并脓毒症，则感染无法控制，多发器官衰竭和死亡率明显升高。在临床上烧伤部位可以分为3个区域，凝固区、血行停滞和堵塞区、充血区。研究发现烧伤伤口处的流出液，例如水泡液和痂下水肿液，能抑制正常中性粒细胞和白细胞的作用，说明烧伤微环境的改变能够影响免疫细胞的功能，增加患者感染的机会并对皮肤移植存活率有影响[1]。因此对烧伤患者烧伤伤口处浸润免疫细胞的变化及功能进行研究，对临床烧伤的治疗具有指导作用，但目前国内相关的研究较少。本文回顾性分析22例重度烧伤患者(总体表面积大于30%)的临床资料，观察浸润性白细胞和淋巴细胞亚群的动态变化，同时分析其同烧伤严重程度的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料选取2013年11月至2014年12月在我院烧伤科治疗的22例中重度烧伤患者。入组标准：烧伤后24 h入院治疗，无原发性肿瘤及免疫功能障碍(HIV)，无严重的脏器功能异常。排除标准：入院时生命体征不稳定，处于休克或者DIC阶段的患者，有严重感染，有呼吸道烧伤及严重创伤的患者。22例患者的年龄18～38岁，平均(28.5±9.0)岁。烧伤范围占总体表面积的(62.3±24.8)%，全层烧伤占总体表面积的(19.5±32.5)%。根据总烧伤面积、深度烧伤面积、复合伤，评估的烧伤严重程度分为中度烧伤组和重度烧伤组。中度烧伤组9例，烧伤总面积为35%～60%，其中深二度以上烧伤面积占13%～25%，2例复合伤，1例骨折，1例吸入性损伤；重度烧伤组13例，烧伤总面积为55%～94%，其中深二度以上烧伤面积占50%～89%，5例复合伤，1例骨折，3例吸入性损伤，1例肺损伤。

1.2 创面处理烧伤创面用磺胺嘧啶银和暴露治疗进行处理。经过液体复苏后，对患者深度烧伤创面进行早期局部切除，包括混合或自体、异体微皮移植，或两者结合治疗。采用针刺活检从患者烧伤部位获取标本(均与患者本人或家属签订知情同意书)；分别在烧伤后1周、2周、3周时获取，分析淋巴细胞的浸润及变化。

1.3 观察指标和检测方法烧伤组织标本分为两部分，一部分用于组织病理学分析，另一部分用于免疫组织化学检测。其中用于免疫组化的样本，用10%中心福尔马林固定，石蜡包埋，切成4μm的切片，并用苏木素-伊红染色。另一部分储存在液氮中，冻存组织切成6μm的切片，用地高辛-生物素过氧化酶复合体(ABC)试剂盒(Vector)和淋巴细胞单克隆抗体[武汉生物产品研究所，包括CD3、CD4、CD8、CD25 (IL-2受体α、IL-2Rα)和CD19]。试验方法简述如下：乙醇固定冰冻组织，1%H2O2孵育，正常兔血清室温孵育以封闭内源性过氧化物酶和非特异性结合位点。磷酸盐缓冲液(PBS)洗后，用(1∶10)～(1∶20)稀释的第一抗体4℃孵育过夜。随后，PBS洗，生物素标记的二抗孵育。加入底物DAB(3，3'-diam inobenzidine)。显色后，用Gill's苏木素复染。梯度乙醇脱色后封片，镜检。一抗的结合位点显示褐色。

1.4 统计学方法应用SPSS12.0统计软件包进行数据分析，计量资料以均数±标准差(±s)表示，组间比较采用LSD-t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 烧伤创面白细胞的浸润反应变化规律中度烧伤组患者在烧伤后3 d出现白细胞浸润反应，但仅有一小部分组织中有白细胞浸润，分布在毛细血管附近。在烧伤1周后，大量的白细胞迁移到烧伤创面的血管中，大量淋巴细胞沿坏死和或组织交界处形成明显的浸润性白细胞区域(见图1)。该区域的细胞大部分由多形核白细胞(polymorphonuclear leukocytes，PMN)组成；还有少量单核细胞(mononuclear cells，MNC)，包括淋巴细胞和巨噬细胞。烧伤2～3周后，MNC是创面处的主要细胞。浸润性白细胞区比以前更完整、更薄。不同创面深度有多层浸润淋巴细胞。坏死组织逐渐同正常组织分离，部分坏死组织开始脱落。严重烧伤组的创面，3 d时很少见到浸润性白细胞。1周后，沿坏死和活组织交界处形成无明显边界的浸润性白细胞区域。但只有极少的淋巴细胞迁移到烧伤创面处(见图2)。2周后，沿坏死和活组织交界处形成明显的浸润性白细胞区域。但该区域很少，且很薄，大部分细胞为PMN，很少有MNC。3周后，浸润性白细胞区域依然是一层，但是变厚。烧伤2～3周后，镜下浸润性白细胞数量无变化。

图1 烧伤后1周中度烧伤患者(HE染色，200×)

图2 烧伤后1周重度烧伤患者(HE染色，200×)

2.2 烧伤创面淋巴细胞亚群的改变烧伤2周后的烧伤切面标本用ABC试剂盒和淋巴细胞抗体检测，高倍镜下(400×)显示，重度烧伤组的患者标本中，每个高倍视野中，浸润区都有6～8个CD3+的细胞(T细胞)，2～3个CD19+的细胞(B细胞)，2～3个CD4+细胞(T辅助细胞，Th细胞)，4～5个CD8+细胞(细胞毒性T细胞，Tc细胞)，未见CD25+细胞(IL-2Rα+细胞)；在中度烧伤组，2周后，CD4+细胞高于CD8+细胞，创面处CD25+细胞很少。重度和中度烧伤患者CD19+细胞无差别，见表1。

表1 烧伤后2周创面移行区高倍镜(400×)视野中淋巴细胞比较(±s)

表1 烧伤后2周创面移行区高倍镜(400×)视野中淋巴细胞比较(±s)

组别中度烧伤组(n=9)重度烧伤组(n=13) t值P值CD3+ 18±5 6±2 8.233 ＜0.05 CD4+ 20±4 2±1 16.127 ＜0.05 CD8+ 10±3 5±1 5.695 ＜0.05 CD19+ 3±2 2±1 1.538 ＞0.05 CD25+ 1±1 0 3.913 ＜0.001

3 讨论

目前对烧伤程度分级系统已广泛接受，但是，对烧伤创面抗感染的研究还很少，大部分研究关注于烧伤部分创面水泡流出液和全层烧伤创面的结痂组织流出液的感染。Zeng等[2]在烧伤水泡液中发现，IgM的含量要低于血清IgM，而IL-1和IL-8的浓度显著增加，其中烧伤结痂流出液，在体外试验中能够抑制细胞介导的免疫反应和PMN凋亡，特别IL-8被认为是人体水泡和皮肤移植供体位点流出液中主要的PMN化学诱导物，这些研究报道，提示了创面流出液对机体免疫防御的影响[3]。但目前为止，创面移行区的免疫细胞动态变化以及同烧伤的严重程度的关系还很少有人研究，我们认为治疗重度烧伤时，需要更多关注深度烧伤部位免疫细胞的反应与烧伤感染的关系。

中性粒细胞是血液中白细胞PMN主要的成分，主要功能是趋化、吞噬、杀菌。中性粒细胞能够自发的杀死入侵的微生物，但是同样也能对自身组织造成伤害。白细胞的浸润需要吸附到血管内皮细胞表面，并同细胞表面的粘附分子、趋化因子、及其受体相互作用后经过一个复杂的过程，才能迁移到创面。非特异性免疫系统在预防和应答创面感染过程中发挥主要作用。当受到损伤或感染时，白细胞吸附到该处的内皮细胞中，通过同补体整联素机制进行迁移，随后迁移到感染区域，识别并杀死微生物。成年人外周循环中的白细胞有20%是淋巴细胞，包括T淋巴细胞和B淋巴细胞，在特异性免疫反应中具有重要作用[4]。因此，PMN和淋巴细胞是宿主天然免疫反应和获得性免疫反应的主要参与者。他们从血液循环中迁移和浸润到受伤部位是炎症反应和免疫反应的结果，对它们的观察有助于我们对烧伤后感染的治疗及皮移植时机的把握。

本研究中，重度烧伤患者1～2周后，烧伤创面区域出现白细胞的浸润。而中度烧伤患者1周后就出现，特别是2周时明显增多，笔者认为这反映了创面具有抵抗病原微生物入侵的能力，这同临床治疗经验相吻合，即重度烧伤后1～2周创面无免疫能力。本研究通过组织病理学分析发现，不同严重程度烧伤患者创面移行区，白细胞浸润的时间和数量不同，说明浸润性白细胞出现的时间和数量，反映了创面移行区的防御能力。烧伤越严重，浸润区域白细胞数量越少，在严重的烧伤患者中，中性粒细胞浸润的延迟可能同该部位趋化因子的产生有关，当白细胞集中受到抑制，会影响杀灭细菌的能力，引起烧伤创面脓毒血症的出现。根据上述结论，在临床实践中，对重症烧伤患者创面的处理，中度烧伤患者不应在7 d时开始，重度患者不应在14 d时开始。烧伤创面的处理方法和时间的选择，也依赖于是否创面防御屏障或颗粒化组织的形成，而对于烧伤严重程度和创面防御能力的关系的了解，将有助于创面局部处理，并获得更好的疗效。

对于烧伤创面移行区白细胞的组成成分的鉴别研究，本文发现在烧伤7 d后，创面浸润区主要由PMN的组成；对于重度烧伤患者，14～21 d主要为MNC。重度烧伤患者组，烧伤14 d后，大量PMN出现在创面浸润区，直到21 d。PMN和淋巴细胞的浸润是急慢性炎症反应的主要特征。结果表明：中度烧伤患者在早期即发生烧伤创面的急性免疫反应，而后迅速转化为慢性炎症反应。重度的炎症反应患者，创面的急性炎症反应开始的晚，持续时间长，转化慢。根据淋巴细胞表面的标志，CD3和CD19分别代表T淋巴细胞(CD3+细胞)和B淋巴细胞(CD19+)[5]。T淋巴细胞通常分为两个亚群，CD4+细胞(Th)，主要功能是诱导或辅助免疫反应。CD8+细胞(Tc或CTL)具有细胞毒效应。CD25是一类αIL-2R受体。CD25+淋巴细胞被激活[5]，免疫组织化学结果表明：不同程度烧伤患者创面，两组间CD19+细胞的数量的无差异，并有相似的浸润性淋巴细胞，但大部分淋巴细胞亚群的数量都有改变。创面Th和CD25+细胞数量的下降，减弱了烧伤创面局部抗感染能力，同时异体移植排异反应也减弱。对于烧伤创面和削痂术和切痂术，围手术期应该给予抗生素。同时也符合重度烧伤患者由于局部以及系统性的免疫抑制阻碍了异体皮肤移植的排异反应的理论。

综上所述，本文阐述了创面细胞反应的动态变化过程[6]，有利于在处理烧伤伤口时做出合理的决定，更加科学合理使用抗生素。同时，本文也阐明了重度烧伤患者中皮肤移植排异反应的延迟发生原因之一[7]。

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Immunocytes changes after severe burn wound and the clinical significance.

LIHong-ming1,ZHOU Jin-wu1,MAO Gao-cai2,CHEN Jian-she1,SHEN Guang-yu1.Departmentof Buns and Plastic Surgery1,Departmentof Pathology2,the 187thHospitalofChinese PLA,Haikou 571159,Hainan,CHINA

Objective To observe the effects of leukocyte subsets variation in burn patients,and to investigate the relationship w ith the severity of burns.M ethods The specimenswere extracted from 22moderate and severe burn patients hospitalized from Nov.2013 to Dec.2014,in 3 days,1 week,2 weeks,3 weeks respectively.By using histochemical and immunohistochemicalmethod,change of leukocyte subsets from transition zone ofmoderate and severe burnswas tested atdifferent timesw ithwhite cellantibodies.Results Infiltration of leukocytes can be observed 3 days after burn in burn area ofmoderate burns,and they grew in number in 2～3 weeks.The leukocytesare polymorphonuclear in early stage andmononuclear in later period.The leukocyteswere rare in early stage after burn in burn area of severe burnsand few polymorphonuclear cells can be found in later period.The numberof T cell,Th cell,Tc cellofmoderate burns was significantly more than that of severe burns(P＜0.05).The number of B cellwas sim ilar in burn area of moderate and severe burns(P＞0.05).Few IL-2Rα+cells can be found in burn area ofmoderate burns and there is no IL-2Rα+cells in severeburns.Conclusion The infiltration of lymphocytes after burns is closely related to burn severity and time.These reflect theability of anti-infection and immune response in injured area.Our resultsprovide a theoreticalbasis for the reasonable treatmentand prolong the lifeof skin transplantation.

Leukocyte;Burn;Infection;Immunohistochem icalmethod

R644

A

1003—6350（2016）16—2624—03

2015-11-09)

doi∶10.3969/j.issn.1003-6350.2016.16.015

李鸿明。E-mail：horster11@163.com