须癣毛癣菌的组织工程皮肤感染模型的构建

曹玉萍 沈永年 吕桂霞 王乐 曾荣 李玲珺 马鹏程 刘维达

210042南京，中国医学科学院 北京协和医学院 皮肤病研究所性病科（曹玉萍），真菌科（沈永年、吕桂霞、刘维达），医务处（王乐、曾荣），药物研究室（李玲珺、马鹏程）

须癣毛癣菌的组织工程皮肤感染模型的构建

曹玉萍 沈永年 吕桂霞 王乐 曾荣 李玲珺 马鹏程 刘维达

210042南京，中国医学科学院 北京协和医学院 皮肤病研究所性病科（曹玉萍），真菌科（沈永年、吕桂霞、刘维达），医务处（王乐、曾荣），药物研究室（李玲珺、马鹏程）

目的 体外构建须癣毛癣菌的组织工程皮肤感染模型。方法 用牛Ⅰ型胶原溶液复合原代成纤维细胞培养3 d后，在其表面利用气液界面培养原代角质形成细胞和黑素细胞12 d得到组织工程皮肤，取新鲜的须癣毛癣菌悬液5 μl对其进行感染，分别在12、24、48、72 h进行HE染色和PAS染色观察。结果 成纤维细胞复合胶原构建结构致密均匀的组织工程真皮，其上角质形成细胞和黑素细胞形成了层次清晰、结构良好的组织工程表皮。须癣毛癣菌感染该组织工程皮肤后，随时间延长，HE染色和PAS染色显示须癣毛癣菌对组织工程皮肤结构的破坏逐渐加重，至48 h，表皮破坏最明显，至72 h，组织工程皮肤的整体结构被菌丝和孢子所替代。结论 初步建立了须癣毛癣菌的组织工程皮肤感染模型。

组织工程；皮肤；动物替代试验；感染；须癣毛癣菌

皮肤癣菌感染是较为常见的一种皮肤浅部真菌感染性疾病，其中以手足癣、体股癣和甲癣最为常见，该类疾病最主要致病菌包括，须癣毛癣菌、红色毛癣菌等，须癣毛癣菌的发病率由于调查样本量和地区间的差异波动于3.36%～40.9%之间［1-2］，作为一种亲动物的皮肤癣菌，须癣毛癣菌可引起局部严重的炎症反应，应引起重视。为了建立抗须癣毛癣菌药物筛选的体外模型，本研究拟利用须癣毛癣菌感染组织工程皮肤，通过观察其对皮肤的破坏程度和入侵深度的变化，初步构建一种新型的须癣毛癣菌感染的体外模型。

资料和方法

一、资料

1.实验标本来源：正常人成纤维细胞（Fb）、角质形成细胞（KC）、黑素细胞（MC）来源于5～25岁正常男性包皮环切术后的包皮（南京鼓楼医院泌尿外科和南京市第一医院泌尿科提供）。须癣毛癣菌［CMCC（F）T.5a］由卫生部医学微生物菌（毒）种保藏管理中心真菌中心［简称CMCC（F）］提供。本研究通过医院伦理委员会批准，患者均签署知情同意书。

2.试剂和仪器：Fb培养基为DMEM完全培养基、KC培养基为DK-SFM、MC培养基为M254，加入HMGS（美国Invitrogen公司）；须癣毛癣菌培养基为PDA；Transwell 12孔板购自美国Corning公司；倒置显微镜（日本Olympus公司）；CO2孵箱（美国Thermo公司）；超净工作台（苏州安泰空气技术有限公司）；隔水式恒温培养箱（上海精密科学仪器有限公司）。

二、方法

1.含色素细胞的组织工程皮肤培养，参见文献［3］。具体方法：将4×105ml-1Fb重悬于Ⅰ型牛胶原混合液中，取1 ml/孔至Transwell 12孔板上室中，放置于37℃，5%CO2下孵育至完全凝固，向其加入1.5 ml培养基培养3 d得组织工程真皮。向真皮表面滴加0.45 ml含4.5×104MC和9×104KC的细胞悬液，置于37℃，5%CO2孵箱培养2 d，第6天进行气液界面培养，第15天结束培养。

2.须癣毛癣菌培养：用PDA培养基培养须癣毛癣菌［CMCC（F）T.5a］7～10d后形成新鲜成熟的菌落，取新鲜成熟的须癣毛癣菌菌落置于盛有1ml生理氯化钠溶液碾磨器中，充分碾磨均匀。用生理氯化钠溶液将其浓度调整至1个麦氏浓度（106个孢子/ml）。

3.构建体外须癣毛癣菌感染的组织工程皮肤模型：由牛胶原溶液复合培养成纤维细胞后与KC、MC共培养得到含色素的组织工程皮肤，在结束培养的第15天，取5 μl须癣毛癣菌滴加于Transwell上室内的皮肤表面。向Transwell下室加入培养基，置于35℃ 5%CO2培养，分别于 12、24、48、72 h 终止培养。

4.须癣毛癣菌感染的组织工程皮肤模型的组织结构观察：中性福尔马林固定培养的组织工程皮肤4 h以上，梯度乙醇脱水后用二甲苯透明，石蜡包埋切片，脱蜡、度乙醇水化后，HE染色，二甲苯透明，中性树胶封片。

5.过碘酸雪夫染色（PAS染色）：切片按常规脱蜡水洗，1%～2%淀粉酶消化25 min后充分水洗，0.5%～1%过碘酸水溶液氧化5 min，Schiff试剂染15 min后水洗，明矾苏木精染核水洗，脱水、二甲苯透明、中性树胶封固。

结 果

一、含色素的组织工程皮肤

利用胶原溶液、成纤维细胞、角质形成细胞及黑素细胞培养15 d后成功建立了含色素的组织工程皮肤。牛Ⅰ型胶原复合培养成纤维细胞形成的组织工程真皮结构致密均匀，可见纵横交错的胶原纤维间散在分布梭形的成纤维细胞，真表皮交界清晰可见，表皮细胞层次紧密、细胞分层较为清楚（图1A），在维持培养72 h后，组织工程皮肤结构稳定（图1B）。

二、须癣毛癣菌的组织工程皮肤感染模型

须癣毛癣菌作用于组织工程皮肤12 h后，表皮层结构完整，可见菌丝粘附现象，图2A中可见数条长短不一的菌丝粘附于表皮上方；须癣毛癣菌感染24 h后，表皮层上方可见垂直方向的菌丝穿入表皮内，表皮上部可见局部菌丝密集分布，染色较深，表皮中部及基底层角质形成细胞结构欠清晰，其间可见纵向分布的菌丝及部分菌丝的横切面（图2B）；须癣毛癣菌感染组织工程皮肤48 h时，表皮层结构严重破坏，可见成团状分布或散在分布的粗细不一的菌丝（图2C）；组织工程皮肤感染后72 h，组织工程皮肤大部分被大量须癣毛癣菌的长短不一的菌丝和孢子所替代（图2D）。

讨 论

本研究利用课题组［3］已建立的含色素的组织工程皮肤感染须癣毛癣菌，在不同时间点对其结构变化进行观察，初步建立了须癣毛癣菌的含色素的组织工程皮肤感染模型。结果发现，随着须癣毛癣菌和组织工程皮肤共培养时间的延长，菌丝由最初的粘附于组织工程皮肤表面，逐渐侵入表皮及真皮，对表皮层结构的破坏在感染后48 h最为显著，在感染72 h后，整个组织工程皮肤基本被须癣毛癣菌的菌丝和孢子所代替。

图1 不同时间点未加菌的含色素的组织工程皮肤（HE×200） 1A：0 h时，真皮内可见纵横交错的胶原纤维，其间散在分布梭形成纤维细胞，表皮结构致密。层次清晰；1B：72 h时，表皮结构与0 h时基本相同，真表皮内细胞层次变化不明显 图2 须癣毛癣菌作用于含色素的组织工程皮肤（PAS×400） 2A：感染12 h后，表皮结构完整，其上可见菌丝粘附；2B：感染24 h后，表皮层内可见大量长短不一的菌丝，表皮层结构仍完整；2C：感染48 h后，表皮内充满纵横交错的菌丝，表皮结构完全破坏；2D：感染72 h后，组织工程皮肤基本被成团的菌丝所替代，皮肤结构及细胞基本消失

须癣毛癣菌是皮肤癣菌病的最常见致病菌之一，在伊朗一项10年的13 469疑似浅部皮肤真菌病的流行病学调查中发现，须癣毛癣菌的感染率高达17.6%［4］。国内亦有多项流行病学研究发现，须癣毛癣菌在皮肤癣菌病中的感染率仅次于红色毛癣菌［5-6］。作为一种亲动物的嗜角质的表皮癣菌，须癣毛癣菌与其他皮肤癣菌相比，能引起的较重的炎症反应，严重者可出现水疱、糜烂及渗液，这一临床现象可以用须癣毛癣菌分泌角蛋白酶的能力远高于红色毛癣菌等其他同类真菌［7］来解释。角蛋白酶可通过降解表皮的角蛋白，使局部角蛋白结构破坏，影响正常表皮的结构并激发局部炎症反应，且分泌的持续时间和强度与作用底物直接相关［8］。因此在体外建立与在体感染最接近的须癣毛癣菌皮肤感染模型，对于须癣毛癣菌的角蛋白酶致病机制的研究有着重要的意义。我们成功建立了须癣毛癣菌感染的组织工程皮肤模型，组织工程皮肤具有分化良好的表皮层结构，其中有较为丰富的角蛋白，是角蛋白酶的良好的自然底物，对于研究须癣毛癣菌重要的角蛋白酶具有得天独厚的条件。与国外报道的须癣毛癣菌体外皮肤模型类似［9］，本研究构建的含色素的组织工程皮肤可用于须癣毛癣菌的抗真菌新药的筛选和评价，也可用来观察须癣毛癣菌与皮肤内各种细胞的相互作用，为今后须癣毛癣菌毒力及体外药效学的研究提供一定的依据。

［1］贾玉琦,帕丽达·阿布利孜.822例浅部真菌病及其致病菌种分析［J］.中国真菌学杂志,2014,9（6）:331-334.

Jia YQ,PaLiDa ABLZ.Analysis of superficial mycosis and pathogenic fungi in 822 cases［J］.Chin J Mycol,2014,9（6）:331-334.

［2］刘允辉,周家骏,徐菊琴.浅部真菌病及其病原菌4 667例分析［J］.现代医药卫生,2014,30（8）:1271-1273.DOI:10.3969/j.issn.1009-5519.2014.08.074.

Liu YH,Zhou JJ,Xu JQ.Analysis of 4667 cases of superficialmycoses and its pathogenic microorganism ［J］.J Mod Med Health,2014,30（8）:1271-1273.DOI:10.3969/j.issn.1009-5519.2014.08.074.

［3］曹玉萍,沈永年,吕桂霞,等.人源性组织工程皮肤白念珠菌感染模型的构建［J］.中华皮肤科杂志,2013,46（8）:551-553.DOI:10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2013.08.005.

Cao YP,Shen YN,Lyu GX,et al.Development of a model forCandida albicansinfection using tissue-engineered human skin substitutes ［J］.Chin J Dermatol,2013,46 （8）:551-553.DOI:10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2013.08.005.

［4］Chadeganipour M,Mohammadi R,Shadzi S.A 10-year study of dermatophytoses in Isfahan,Iran ［J］.J Clin Lab Anal,2015.DOI:10.1002/jcla.21852.［Epub ahead of print］

［5］米拉,帕丽达·阿布利孜,刘旭,等.260例浅部真菌病及致病菌种分析［J］.中国微生态学杂志,2011,23（7）:637-640.

Mi L,PaLiDa ABLZ,Liu Xu,et al.Aanlysis on 260 cases of superficial mycosis and its causative agents［J］.Chin J Microecol,2011,23（7）:637-640.

［6］张伟铮,陈力,赵瑾,等.297例浅部真菌病临床及病原菌菌种分析［J］.中国真菌学杂志,2014,9（1）:28-30.

Zhang WZ,Chen Li,Zhao J,et al.Analysis of 297 cases of superficial mycosis and its pathogenic fungi strains ［J］.Chin J Mycol,2014,9（1）:28-30.

［7］肖媛媛,王爱平,曹存巍,等.皮肤癣菌体外蛋白水解酶活性测定［J］.中国真菌学杂志 ,2008,3（1）:5-7.DOI:10.3969/j.issn.1673-3827.2008.01.002.Xiao YY,Wang AP,Cao CW,et al.In vitroproteinase activity of dermatophytes［J］.ChinJMycol,2008,3（1）:5-7.DOI:10.3969/j.issn.1673-3827.2008.01.002.

［8］Siesenop U,Bohm KH.Comparative studies on keratinase production ofTrichophyton mentagrophytesstrains of animal origin［J］.Mycoses,1995,38（5-6）:205-209.DOI:10.1111/j.1439-0507.1995.tb00050.x.

［9］Rashid A,Edward M,Richardson MD.Activity of terbinafine onTrichophyton mentagrophytesin a human living skin equivalent model［J］.J Med Vet Mycol,1995,33（4）:229-233.DOI:10.1080/02681219580000471.

Construction of aTrichophyton mentagrophytes-infected tissue-engineered skin model

Cao Yuping,Shen Yongnian,Lyu Guixia,Wang Le,Zeng Rong,Li Lingjun,Ma Pengcheng,Liu Weida
Department of Sexually Transmitted Disease,Institute of Dermatology,Chinese Academy of Medical Science and Peking Union Medical College,Nanjing 210042,China （Cao YP）;Department of Mycology,Institute of Dermatology,Chinese Academy of Medical Science and Peking Union Medical College,Nanjing 210042,China（Shen YN,Lyu GX,Liu WD）;Division of Medical Affairs,Institute of Dermatology,Chinese Academy of Medical Science and Peking Union Medical College,Nanjing 210042,China（Wang L,Zeng R）;Pharmacal Research Laboratory,Institute of Dermatology,Chinese Academy of Medical Science and Peking Union Medical College,Nanjing 210042,China（Li LJ,Ma PC）

ObjectiveTo establish aTrichophyton mentagrophytes-infected tissue-engineered skin modelin vitro.MethodsPrimary fibroblasts were cultured with the presence of typeⅠbovine collagen for 3 days to form tissueengineered dermis.Then,primary keratinocytes and melanocytes were co-cultured on the surface（namely air-liquid interface)of the artificial dermis for another 12 days to form a tissue-engineered skin model.Five microliters of freshTrichophyton mentagrophytessuspensions were used to infect the tissue-engineered skin model.Hematoxylin and eosin（HE)staining and periodic acid-Schiff（PAS）staining were conducted to observe the structure of the cultures at 12,24,48 and 72 hours separately after the infection.ResultsA tissue-engineered dermal equivalent with a compact and uniform structure was formed by the culture of fibroblasts with the presence of typeⅠbovine collagen,and a well-stratified and-structured epidermis was formed by cocultured keratinocytes and melanocytes on the surface of the dermis.After infection withTrichophyton mentagrophytes,the structure of tissue-engineered skin was gradually destroyed over time,and epidermal destruction was severest at 48 hours;the entire structure of the tissue-engineered skin was replaced by hyphae and spores at 72 hours.ConclusionATrichophyton mentagrophytes-infected tissue-engineered skin model has been preliminarily established.

Tissue engineering;Skin;Animal testing alternatives;Infection;Trichophyton mentagrophytes

s:Liu Weida,Email:liumyco@hotmail.com;Ma Pengcheng,Email:mpc815@163.com

2015-06-04）

（本文编辑：吴晓初）

刘维达，Email：liumyco@hotmail.com；马鹏程，Email：mpc815@163.com

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2016.01.008

国家科技重大专项（2009ZX09303-005）；江苏省自然科学基金（BK2008092）；江苏省临床医学科技专项（BL2012003）；北京协和医学院协和青年基金（33320140051）

Fund programs:National Science and Technology Major Project of China （2009ZX09303-005）;Natural Science Foundation of Jiangsu Province of China （BK2008092）;Jiangsu Provincial Special Program of Medical Science（BL2012003）;Union Youth Foundation of Peking Union MedicalCollege in 2014（33320140051）