T细胞免疫球蛋白黏蛋白分子3对黑素瘤TRP-2180-188肽疫苗刺激小鼠淋巴细胞的影响

吕雅琳 周晓伟 胡彬 吴琼 曾学思 刘毅 孙建方

210042南京，中国医学科学院 北京协和医学院 皮肤病研究所病理科（吕雅琳、胡彬、吴琼、曾学思、刘毅、孙建方），江苏省皮肤病与性病分子生物学重点实验室（周晓伟）

T细胞免疫球蛋白黏蛋白分子3对黑素瘤TRP-2180-188肽疫苗刺激小鼠淋巴细胞的影响

吕雅琳 周晓伟 胡彬 吴琼 曾学思 刘毅 孙建方

210042南京，中国医学科学院 北京协和医学院 皮肤病研究所病理科（吕雅琳、胡彬、吴琼、曾学思、刘毅、孙建方），江苏省皮肤病与性病分子生物学重点实验室（周晓伟）

目的 探讨体外T细胞免疫球蛋白黏蛋白分子-3（TIM-3）对与小鼠黑素瘤B16F10细胞共培养的酪氨酸相关蛋白-2（TRP-2180-188）抗原肽刺激小鼠淋巴细胞的影响。方法 构建TIM-3重组质粒pFUSE-TIM-3-mIgG2Aae1-Fc2，分别转染重组质粒及空质粒pFUSE-mIgG2Aae1-Fc2至人上皮293T细胞，继续培养48 h，制备含TIM-3、免疫球蛋白（Ig-tail）的上清液。TRP-2180-188肽疫苗免疫C57BL/6小鼠，分离小鼠脾淋巴细胞，用TRP-2180-188抗原肽和白细胞介素（IL）-2刺激培养5 d，以未刺激细胞作为对照组。构建B16F10细胞与上述TRP-2180-188抗原肽刺激淋巴细胞共培养体系，分为空白对照组（加293T细胞培养48 h上清液）、TIM-3组（加含TIM-3上清液）、阴性对照组（加含Ig-tail上清液）。CCK-8法检测细胞增殖情况，酶联免疫吸附试验（ELISA）检测共培养体系中干扰素（IFN）-γ和肿瘤坏死因子（TNF）-α浓度，流式细胞仪检测共培养体系中CD8+T淋巴细胞。结果 酶切和测序鉴定证实目的基因正确插入真核表达载体中，检测到转染重组质粒pFUSE-TIM-3-mIgG2Aae1-Fc2的293T细胞上清液中有TIM-3表达，转染空质粒pFUSE-mIgG2Aae1-Fc2的293T细胞上清液中有Ig-tail的表达。CCK-8法检测显示24 h时空白对照组、阴性对照组、TIM-3组淋巴细胞增殖活力分别为（100.00±10.42）%、（108.70±9.90）%、（78.06±6.37）%，48 h 时分别为（100.00±6.24）%、（168.00±2.98）%、（42.93±5.93）%；24 h、48 h时TIM-3组淋巴细胞活力低于空白对照组和阴性对照组（均P＜0.05）。TIM-3组48 h相比24 h淋巴细胞增殖倍数低于空白对照组和阴性对照组（均P＜0.05）。24 h时，空白对照组、阴性对照组、TIM-3组 IFN-γ浓度分别为（216.44±7.85）、（223.67±7.79）、（192.96±5.05）ng/L，48 h时分别为（230.06±4.23）、（167.24±3.33）、（54.95±0.57）ng/L。24 h、48 h时，TIM-3组 IFN-γ 浓度低于空白对照组和阴性对照组（均P＜0.05）。24 h、48 h时，TIM-3组TNF-α浓度低于空白对照组和阴性对照组（均P＜0.05）。24 h时空白对照组、阴性对照组、TIM-3组CD8+T淋巴细胞中位数分别为0.421%、2.22%、3.30%，48 h时分别为0.577%、0.691%、4.06%。24 h、48 h时TIM-3组CD8+T淋巴细胞中位数高于空白对照组和阴性对对照组。结论 TIM-3在体外能够抑制B16F10细胞与TRP-2180-188抗原肽刺激淋巴细胞共培养体系中淋巴细胞增殖和分泌IFN-γ、TNF-α，提高CD8+T淋巴细胞。

黑色素瘤，实验性；疫苗，亚单位；T淋巴细胞，细胞毒性；干扰素γ；T细胞免疫球蛋白粘蛋白-3

T细胞免疫球蛋白黏蛋白分子（T cell immunoglobulin and mucin domain，Tim）家族基因主要表达于T细胞，其编码的蛋白包括信号肽、免疫球蛋白区、黏蛋白区、跨膜区和有磷酸化位点的胞内区［1］。TIM家族在鼠中包括8个成员，在人类中包括3个成员。TIM-3为该家族成员，是一种重要的负性调控分子，抑制Th1介导的自身免疫反应和同种免疫反应，促进免疫耐受，参与肿瘤的免疫逃逸。本研究探讨体外TIM-3对黑素瘤TRP-2180-188肽疫苗刺激小鼠淋巴细胞增殖、干扰素（IFN）γ和肿瘤坏死因子（TNF）α分泌及对CD8+T淋巴细胞的影响。

资料和方法

一、动物、细胞、试剂和仪器

6周龄SPF级雌性C57BL/6小鼠（扬州大学实验动物中心，合格证201512801），DH5α感受态细胞（大连Takara公司）；人肾上皮细胞293T细胞（中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心），小鼠黑素瘤细胞株B16F10（美国标准生物品收藏中心），pFUSE-mIgG2Aae1-Fc2质粒（美国InvivoGen公司），RPMI-1640培养基、Opti-MEM培养基、胎牛血清、胰蛋白胨、酵母浸出粉（美国Gibco公司），脂质体LipofectamineTM2000、胰蛋白酶、CpG-ODN1826、TRP-2180-188抗原肽（美国Invitrogen公司），DNA分子标志物（大连TAKARA公司），抗生素Zeocin（法国Cayla公司），山羊抗小鼠IgG2a单抗（美国Proteintech公司），弗氏不完全佐剂、二甲基亚砜（DMSO）、小鼠白细胞介素（IL）2（美国 Sigma公司），小鼠淋巴细胞分离液、鼠IFN-γ ELISA试剂盒、鼠TNF-α ELISA试剂盒（深圳达科为生物技术有限公司），丝裂霉素（江苏泰诺源生物技术有限公司），CCK-8细胞计数试剂盒（南京诺唯赞生物科技有限公司），鼠CD8a抗体（德国美天旎生物公司），紫外分光光度计（DU800，美国Beckham Coulter公司），PCR仪、凝胶成像及分析装置（美国Bio-Rad公司），流式细胞仪（FACSVerseTM，美国BD公司）。

二、TIM-3真核表达载体的构建及表达

1.TIM-3真核表达载体的构建及验证：在线检索TIM-3蛋白质氨基酸序列及开放读码框ORF，通过BLAST比对由ORF得到的氨基酸序列和核酸序列。通过TMpred预测TIM-3可能的跨膜区域，同时参照Uniprot蛋白数据库检索结果确定TIM-3胞外域。根据其胞外域结构及相应的ORF用Primer premier5设计引物，并由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

小鼠TIM-3蛋白包含281个氨基酸，预测其中1-19位为信号肽，20-193为胞外域，194-214位为跨膜区。设计扩增优化后的Tim3Ig融合蛋白（1-193位氨基酸）的核酸序列，正向引物：5′-GAATTC GCCGCCACCATG-3′，反向引物：5′-GGATCCTCAA TGATGATG-3′。

从小鼠淋巴结细胞RT-PCR获得的原始序列构建到pFUSE-mIgG2Aae1-Fc2质粒上的表达量很低，分析原始序列包含7个稀有密码子，对其进行优化，但不影响小鼠TIM-3的体外表达，并由上海捷瑞生物工程有限公司合成，将优化后的表达序列连接到pFUSE-mIgG2Aae1-Fc2质粒上，酶切验证并测序比对。

2.TIM-3真核表达载体的表达：将状态良好、处于对数生长期的293T细胞按1×105细胞/孔的浓度接种于24孔培养板中，加入500 μl含10%胎牛血清（FBS）的RPMI 1640完全培养基，于37℃、5%CO2环境中培养，细胞汇合至90%以上时开始转染，将培养基更换为Opti-MEM无血清培养基，每孔400 μl；参照 LipofectamineTM2000 操作说明进行pFUSE-mIgG2Aae1-Fc2质粒及pFUSE-TIM-3-mIgG2Aae1-Fc2质粒转染，ELISA法检测转染后48 h上清液中TIM-3及Ig-tail的浓度，冻存上清液备用。

三、TRP-2180-188肽疫苗免疫C57BL/6小鼠及B16F10细胞与TRP-2180-188抗原肽刺激淋巴细胞共培养体系的构建

1.TRP-2180-188肽疫苗免疫C57BL/6小鼠：初次免疫每份肽疫苗成分：5 μl TRP-2180-188抗原肽（10 g/L），45 μl 30%DMSO，50 μl CpG1826（1 g/L），50 μl弗氏不完全佐剂；加强免疫每份肽疫苗成分：10 μl TRP-2180-188抗原肽（10 g/L），40 μl 30%DMSO，50 μl CpG1826（1 g/L），50 μl弗氏不完全佐剂。将充分乳化后的肽疫苗于小鼠股外侧分双侧皮下注射；免疫分初次免疫和加强免疫，将第1次免疫的时间设为第0天，初次免疫时间为第0，3，6天，共3次，加强免疫为第20天，共1次。

2.B16F10细胞与TRP-2180-188抗原肽刺激淋巴细胞共培养：断颈处死加强免疫后1周的C57BL/6小鼠，取脾脏，参照小鼠淋巴细胞分离液操作说明进行脾淋巴细胞提取，将提取的淋巴细胞按照2×106/ml浓度接种于含10%FBS的RPMI 1640完全培养基中，同时加入终浓度为10 μmol/l的TRP-2180-188抗原肽和20μg/L（相当于≥100U/ml）IL-2，在37℃、5%CO2的细胞培养箱中培养5 d。培养过程中同时进行B16F10细胞的培养与传代，用终浓度25 mg/L丝裂霉素处理B16F10细胞，完全洗去丝裂霉素后与前述体外培养5 d的脾淋巴细胞共培养，并在倒置显微镜下进行观察。

四、TIM-3对与小鼠黑素瘤B16F10细胞共培养的TRP-2180-188抗原肽刺激小鼠淋巴细胞的影响

1.实验分组：按照每孔TRP-2180-188肽疫苗刺激脾淋巴细胞浓度2×106/ml、B16F10细胞浓度2×105/ml进行共培养，分组如下：空白对照组：加293T细胞培养48 h上清液；阴性对照组：加含Ig-tail（转染pFUSE-mIgG2Aae1-Fc2空质粒的293T细胞培养48 h）上清液；TIM-3组：加含TIM-3（转染pFUSE-TIM-3-mIgG2Aae1-Fc2质粒的293T细胞培养48 h）上清液。

2.CCK-8法检测共培养体系中淋巴细胞增殖情况：在96孔板中，参照上述分组方法（本实验增加一组只含有293T细胞培养48 h上清液和经过丝裂霉素处理的B16F10细胞的空白组），每组设3个复孔，用含10%胎牛血清的RPMI 1640完全培养基或者上清液调整每孔最终总体积为100 μl，于37℃，5%CO2培养箱中培养，分别于24 h和48 h参照CCK-8试剂盒操作说明检测450 nm处吸光度A值并进行结果分析。细胞活力=（实验组A值-空白组A值）/（空白对照组A值-空白组A值）×100%。48 h淋巴细胞相对24 h增殖倍数=（实验组48 hA值-空白组A值）/（实验组24 hA值-空白组A值）。

3.ELISA检测各组共培养体系24 h、48 h上清液中IFN-γ和TNF-α分泌情况：分别收集各组B16F10细胞与TRP-2180-188抗原肽刺激脾淋巴细胞共培养24 h和48 h的上清液，参照ELISA试剂盒操作说明检测上清液中IFN-γ和TNF-α浓度。

4.流式细胞仪检测共培养体系中24 h和48 h CD8+T淋巴细胞：从共培养体系中吸取悬浮的淋巴细胞并计数；将细胞300×g离心10 min，完全去除上清液；用 45 μl重悬 106细胞；加 5 μl CD8a 抗体；4℃避光孵育10 min；加1～2 ml缓冲液，300×g离心10 min，完全去除上清液；用500 μl磷酸盐缓冲液（PBS）重悬细胞并进行流式细胞仪检测，用FlowJo7.6.1软件进行分析。

五、统计学方法

结 果

一、TIM-3真核表达载体的构建及表达

将579 bp的目的片段连接至pFUSE-mIgG2Aae1-Fc2质粒，得到pFUSE-TIM-3-mIgG2Aae1-Fc2重组质粒，并对重组质粒进行EcoRⅠ/BgⅢ双酶切验证，得到预期大小目的片段，见图1。测序验证结果与目标序列一致。

pFUSE-mIgG2Aae1-Fc2空质粒和pFUSETIM-3-mIgG2Aae1-Fc2重组质粒转染293T细胞后48 h，检测培养上清液中TIM-3和Ig-tail的浓度分别为 28.46、23.12 μg/L。

图1 pFUSE-TIM-3-mIgG2Aae1-Fc2重组质粒的EcoRⅠ/BgⅢ双酶切验证 1：重组质粒（3 000 bp）；2：EcoRⅠ/BgⅢ双酶切重组质粒（酶切片段579 bp）；3：标准参照物

二、B16F10细胞与TRP-2180-188抗原肽刺激淋巴细胞共培养体系构建

1.TRP-2180-188肽疫苗免疫C57BL/6小鼠：经TRP-2180-188肽疫苗加强免疫后1周的C57BL/6小鼠淋巴结较未免疫小鼠增大5～6倍，脾脏较未免疫小鼠增大1.5倍，表明肽疫苗免疫成功。

2.丝裂霉素处理B16F10细胞：24 h和48 h分别在光镜下观察显示：经丝裂霉素处理后B16F10细胞密度明显低于未处理的细胞。CCK-8法检测显示，24 h空白组、经丝裂霉素处理组、未经丝裂霉素处理组A值分别为 0.262±0.043、0.347±0.014、0.698±0.042，48 h时分别为 0.261±0.012、0.331±0.011、1.121±0.040。24 h和48 h时，未经丝裂霉素处理的B16F10细胞A值均高于经丝裂霉素处理B16F10细胞（均P＜0.05）；经丝裂霉素处理的B16F10细胞24 h与48 h时的A值差异无统计学意义（P＞0.05）；未经丝裂霉素处理的B16F10细胞48 h时A值明显高于24 h时（P＜0.05）。

3.TRP-2180-188抗原肽、IL-2体外刺激免疫后小鼠脾淋巴细胞：光镜下观察发现，未经TRP-2180-188抗原肽、IL-2体外刺激的细胞形态基本无变化，经TRP-2180-188抗原肽、IL-2体外刺激的淋巴细胞随培养时间延长，逐渐出现集落性增殖，并且出现体积增大、胞核大、胞质丰富的细胞。见图2。

4.B16F10细胞与TRP-2180-188肽疫苗刺激淋巴细胞共培养：随培养时间的延长，淋巴细胞体积增大、胞核变大、胞质丰富，逐渐出现淋巴细胞向B16F10细胞周围聚集的现象。见图3。

图2 光镜下观察免疫后小鼠脾淋巴细胞培养5 d后的形态（×40） 2A：未接受刺激细胞：细胞形态基本无变化；2B：接受TRP-2180-188抗原肽、IL-2刺激细胞：细胞集落性增殖，出现体积增大、胞核大、胞质丰富的细胞

图3 光镜下观察小鼠脾淋巴细胞与B16F10共培养体系（×100） 3A：未接受TRP-2180-188抗原肽、IL-2刺激的小鼠脾淋巴细胞与B16F10共培养48 h，淋巴细胞形态无变化，向B16F10细胞周围聚集；3B：经体外刺激的小鼠脾淋巴细胞与B16F10共培养48 h，淋巴细胞体积增大，胞核变大，胞质丰富，并向B16F10细胞周围聚集

三、共培养体系中淋巴细胞增殖情况

24 h时空白对照组、阴性对照组、TIM-3组淋巴细胞活力（%）分别为100.00±10.42、108.70±9.90、78.06±6.37，48 h时分别为 100.00±6.24、168.00±2.98、42.93±5.93。24 h、48 h时 TIM-3组淋巴细胞活力低于空白对照组和阴性对照组（均P＜0.05）。空白对照组、阴性对照组、TIM-3组48 h相对24 h淋巴细胞增殖倍数分别为3.84 0.59、5.91 0.63、2.08 0.19，TIM-3组低于空白对照组和阴性对照组（均P＜0.05）。

四、共培养体系24、48 h上清液中IFN-γ和TNF-α分泌情况和CD8+T淋巴细胞

24、48 h时TIM-3组上清液中IFN-γ浓度均低于空白对照组和阴性对照组（P＜0.05），TNF-α浓度均低于空白对照组和阴性对照组（P＜0.05）。24、48 h时，TIM-3组共培养体系中CD8+T淋巴细胞中位数高于空白对照组和阴性对照组。见表1。

表1 淋巴细胞共培养体系24 h和48 h时IFN-γ、TNF-α浓度及CD8+T淋巴细胞

讨 论

TIM-3是一种负性免疫调节分子，是区分Thl和Th2细胞的表面标志，在产IFN-γ的活化T淋巴细胞中表达上调。小鼠TIM-3有全长跨膜型TIM-3（full-length membrane-anchored form of TIM-3，flTIM-3）和可溶型TIM-3（soluble form of TIM-3，sTIM-3）两种形式。flTIM-3含有信号肽、免疫球蛋白V区、黏蛋白区、跨膜区和胞质区。sTIM-3仅含有信号肽、免疫球蛋白V区和胞质区。研究表明TIM-3还表达于Th17细胞、Treg细胞、单核巨噬细胞、自然杀伤细胞、树突细胞、肥大细胞、髓系来源抑制细胞、淋巴瘤相关的内皮细胞和某些肿瘤细胞［2-5］。凝集素家族中β半乳糖苷结合凝集素9是TIM-3的主要配体，在组织内分布广泛，二者结合后，给T细胞提供了一种负性共刺激信号，下调免疫反应，抑制Th1介导的自身免疫反应和同种免疫反应，促进免疫耐受［6-7］。TIM-3在肿瘤组织中选择性表达，并在多水平参与肿瘤免疫：与T细胞功能耗竭有关，参与肿瘤免疫中T细胞应答的负性调控；促进髓系来源抑制细胞的扩增，使肿瘤发生免疫逃逸，促进肿瘤发展；也可能促进树突细胞成熟和激活自然杀伤细胞增强肿瘤免疫应答。在实体和血液系统恶性肿瘤的动物模型研究中，TIM-3在肿瘤介导的免疫抑制中起重要作用，在大部分受抑制或者功能缺陷的CD8+T细胞表达TIM-3［8-10］。阻断TIM-3后出现与阻断程序性死亡1（PD-1）通路相似的抗肿瘤活性［11］。阻断TIM-3可以恢复IFN-γ、TNF-α的分泌和NY-ESO-1特异性CD8+T细胞的的增殖。以上研究提示，单独使用TIM-3靶向免疫治疗或者联合其他方法有治疗肿瘤的可能性。

本研究探讨体外条件下，包含信号肽及胞外区的TIM-3融合蛋白对黑素瘤TRP-2180-188肽疫苗刺激小鼠淋巴细胞影响，期望能够提高淋巴细胞增殖及细胞因子分泌水平。但是我们的研究发现，包含信号肽及胞外区的TIM-3融合蛋白降低了黑素瘤TRP-2180-188肽疫苗刺激小鼠淋巴细胞的增殖和IFN-γ、TNF-α分泌水平，分析原因可能与我们研究中合成的TIM-3融合蛋白为仅含信号肽及胞外区的TIM-3，与sTIM-3类似，而非flTIM-3。以往的研究主要应用 flTIM-3［12-13］，flTIM-3 能够促进 Th1 细胞扩增，抑制Treg细胞增殖。目前对sTIM-3研究较少，其功能及相关机制尚不明确；有研究表明在转染sTIM-3质粒的小鼠黑素瘤模型中，sTIM-3促进了肿瘤的生长，降低荷瘤小鼠生存时间，体外实验显示sTIM-3抑制T细胞对抗原特异性刺激的反应，抑制Th1细胞IL-2及IFN-γ的产生，用抗TIM-3单抗阻断sTIM-3后可恢复T细胞功能，均提示sTIM-3抑制T细胞的功能［14］，我们的研究与该结果一致。

我们的研究中，TIM-3组CD8+T淋巴细胞高于空白对照组和阴性对照组，可能与TIM-3提高CD8+T淋巴细胞某类亚群的增殖有关，我们在后续试验中将对T细胞表型进行进一步研究，从而探讨TIM-3对T细胞增殖和分化的影响。

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Effect of T-cell immunoglobulin and mucin domain-3 on TRP-2180-188peptide-stimulated murine spleen lymphocytes co-cultured with B16F10 murine melanoma cells

Lyu Yalin,Zhou Xiaowei,Hu Bin,Wu Qiong,Zeng Xuesi,Liu Yi,Sun Jianfang
Department of Pathology,Institute of Dermatology,Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College,Nanjing 210042,China（Lyu YL,Hu B,Wu Q,Zeng XS,Liu Y,Sun JF）;Jiangsu Key Laboratory of Molecular Biology for Skin Diseases and STIs,Nanjing 210042,China（Zhou XW）

ObjectiveTo evaluate the effectofT-cellimmunoglobulinandmucindomain-3（TIM-3）on TRP-2180-188peptide-stimulated murine spleen lymphocytes co-cultured with B16F10 murine melanoma cells.MethodsA recombinant plasmid pFUSE-TIM-3-mIgG2Aae1-Fc2 encoding TIM-3 was constructed.Then,the recombinant plasmid and an empty plasmid pFUSE-mIgG2Aae1-Fc2 were transfected into human 293T epithelial cells followed by 48-hour culture for the preparation of supernatants containing TIM-3 and Ig-tail respectively.C57BL/6 mice were immunized with the TRP-2180-188peptide vaccine for 4 sessions.One week after the last vaccination,C57BL/6 mice were sacrificed,and spleen lymphocytes were collected and then cultured with the TRP-2180-188peptide and interleukin-2（IL-2）for 5 days,with lymphocytes untreated with the TRP-2180-188peptide or IL-2 serving as the control group.Mitomycin-treated B16F10 murine melanoma cells and TRP-2180-188peptide-stimulated lymphocytes were co-cultured with the presence of supernatants of 293T cells that had been cultured for 48 hours（blank control group）,TIM-3-containing supernatants（TIM-3 group）and Ig-tail-containing supernatants（negative control group）separately.After 24 and 48 hours of co-culture,cell counting kit-8（CCK-8）assay was performed to estimate the proliferative activity of lymphocytes,enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）to determine the supernatant levels of interferon （INF）-γ and tumor necrosis factor （TNF）-α,flow cytometry to determine the percentage of CD8+T cells in the co-culture system.ResultsEnzyme digestion and sequence analysis showed that the TIM-3 gene was successfully inserted into the eukaryotic expression plasmid.After 48-hour culture,TIM-3 and Ig-tail expressions were detected in the supernatants of 293T cells transfected with the recombinant plasmid and empty plasmid respectively.As CCK-8 assay showed,the proliferative activity of lymphocytes was significantly lower in the TIM-3 group than in the blank control group and negative control group after 24-and 48-hour culture（78.06%±6.37%vs.100.00%±10.42%and 108.70%±9.90%at 24 hours,42.93%±5.93%vs.100.00%±6.24%and 168.00%±2.98%at 48 hours,allP＜0.05）,so was the ratio of cellular proliferative activity at 48 hours to that at 24 hours （allP＜0.05）.Compared with the blank control group and negative control group,the TIM-3 group showed significantly decreased supernatant levels of IFN-γ and TNF-α after 24-hour （IFN-γ：192.96±5.05 ng/L vs.216.44±7.85 ng/L and 223.67±7.79 ng/L,bothP＜0.05;TNF-α：58.43±0.26 ng/L vs.26.43±0.01 ng/L and 86.85±1.12 ng/L,bothP＜0.05）and 48-hour culture （IFN-γ：54.95±0.57 ng/L vs.230.06±4.23 ng/L and 167.24±3.33 ng/L,bothP＜0.05;TNF-α：30.23±0.26 ng/L vs.26.84±0.20 ng/L and 45.34±0.22 ng/L,bothP＜0.05）.In addition,the median percentage of CD8+T cells was significantly increased in the TIM-3 group compared with the blank control group and negative control group after 24-and 48-hour culture（3.30%vs.0.421%and 2.22%at 24 hours,4.06%vs.0.577%and 0.691%at 48 hours,allP＜0.05）.Conclusion TIM-3in vitrocan suppress the proliferative activity of and secretion of IFN-γ and TNF-α by lymphocytes,but increase the percentage of CD8+T cells in the co-culture system of TRP-2180-188peptide-stimulated lymphocytes and B16F10 cells.

Melanoma,experimental;Vaccines,subunit;T-lymphocytes,cytotoxic;Interferon-gamma;T cell immunoglobulin and mucin domain-3

s：Liu Yi,Email：dr.liuyi@gmail.com;Sun Jianfang,Email：sunjf57@163.com

2015-05-11）

（本文编辑：尚淑贤）

刘毅，Email：dr.liuyi@gmail.com；孙建方，Email：sunjf57@163.com

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2016.02.002

国家自然科学基金（81171513）；江苏省自然科学基金（BK2012506、BK20131063）；2012高等学校博士学科点专项科研基金（20121106110040）

Fund programs:National Natural Science Foundation of China（81171513）;Natural Science Foundation of Jiangsu Province of China（BK2012506,BK20131063）;Research Fund for the Doctoral Program of Higher Education of China in 2012（20121106110040）