丁酸盐二甲双胍对乳腺癌干细胞的抗肿瘤活性及细胞毒性作用研究

王文蓉

（湖北省荆州市第三人民医院，湖北荆州434000）

丁酸盐二甲双胍对乳腺癌干细胞的抗肿瘤活性及细胞毒性作用研究

王文蓉

（湖北省荆州市第三人民医院，湖北荆州434000）

目的探讨丁酸盐二甲双胍对乳腺癌干细胞抗肿瘤活性及细胞毒性作用。方法利用超低粘附悬浮培养法，从MDA-MB-231细胞中，获得乳腺癌干细胞样细胞。随机将其分为对照组（化疗药物）和观察组（丁酸盐二甲双胍联合化疗药物），在缺氧状态下分别处理细胞，通过流式细胞仪，检测两组细胞凋亡情况，利用四甲基偶氮唑盐（MTT）法检测乳腺癌干细胞增殖活性。结果对照组丁酸盐二甲双胍能够促进MDA-MB-231细胞凋亡，对ER阳性的MCF-7无明显影响；观察组丁酸盐二甲双胍能够明显增加乳腺癌干细胞对化疗药物的敏感性。结论丁酸盐二甲双胍可促进乳腺癌干细胞凋亡，增强乳腺癌干细胞对化疗药物的敏感性。

丁酸盐二甲双胍；乳腺癌干细胞；细胞凋亡；细胞增殖

乳腺癌为女性最常见的恶性肿瘤，随着人口年龄趋于老年化、饮食结构多样化，发病率呈逐年增高、年轻化趋势［1-2］。三阴性乳腺癌［雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）、人类表皮生长因子受体2（HER2）均阴性］具有较高的复发率、转移率、死亡率，严重影响患者的生活质量，甚至危及生命［3］。研究证实［4］，内分泌激素干预治疗能够明显防治乳腺癌，其中最常见的是特异性雌激素受体、芳香化酶类抑制剂类药物治疗。二甲双胍作为临床常用降糖药物，在降糖的同时还能增加肿瘤细胞对化疗药物的敏感性，因此其可作为抗肿瘤药物应用于临床［5-6］。本研究中，利用超低粘附悬浮培养法，从MDAMB-231细胞中获得乳腺癌干细胞样细胞，探讨丁酸盐二甲双胍对乳腺癌干细胞抗肿瘤活性及细胞毒性的增强作用，现报道如下。

1　材料与方法

1.1材料

仪器及试药：细胞凋亡试剂盒（上海七海复泰生物有限公司）；细胞增殖试剂盒（美国Promega公司）；流式细胞仪BD FACSCantoll（美国BD公司）。DMEM培养基、RPMI-1640培养基、胰岛素、化疗药物多柔比星（Doxorubicin）均购自Sigma公司；胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司）；丁酸盐二甲双胍缓释片（青岛黄海制药有限责任公司，国药准字H20040154，规格为每片0.5 g）。

细胞系：乳腺癌三阴性MDA-MB-231细胞及MCF-7（ER阳性）细胞购自中科院上海生命科学研究院细胞资源中心，在含有10%胎牛血清的DMEM，RPMI-1640培养基，37℃，5%CO2条件下培养。

1.2方法

乳腺癌干细胞培养：MDA-MB-231细胞经胰酶消化，制成单细胞悬液，接种于6孔超低粘附培养板，每孔约5 000个，再进行干细胞培养扩增处理。

流式细胞仪检测乳腺癌干细胞的细胞凋亡：将乳腺癌干细胞接种于3.5 cm培养皿，每个皿约2×105个，常氧（21%O2）条件下，孵育48 h，严格按照Annexin V/PI双染色试剂盒说明书，进行荧光染色处理，随后根据流式细胞仪进行双变量分析。

四甲基偶氮唑盐（MTT）法检测乳腺癌干细胞的细胞增殖：将乳腺癌干细胞接种于96孔培养板，每孔约1×104个，于常氧状态下孵育过夜，次日分别进行对照组（0.2 μmol/L阿霉素）和观察组（5 mmol/L丁酸盐二甲双胍+0.2 μmol/L阿霉素）各处理组的细胞处理，各组16孔，再将培养板治愈缺氧条件下（1%O2），孵育11 d，严格按照细胞增殖试剂盒说明书，进行乳腺癌干细胞细胞增殖活性的检测。

1.3统计学处理

采用SPSS 18.0统计学软件，计量资料以均数±标准差表示，多组间以方差分析处理，两两比较采用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1乳腺癌干细胞成功培养

从乳腺癌细胞MDA-MB-231中，利用超低粘附培养法，成功培养出乳腺癌干细胞，体外培养6 d左右，形成乳腺肿瘤球，见图1。

2.2丁酸盐二甲双胍对乳腺癌干细胞凋亡的影响

经Annexin V/PI双染色法检测MDA-MB-321及MCF-7细胞在缺氧条件下处理48 h后凋亡情况，结果丁酸盐二甲双胍明显促进乳腺癌干细胞凋亡，而丁酸盐二甲双胍对MCF-7细胞凋亡作用影响不大，见图2。

2.3丁酸盐二甲双胍增强乳腺癌干细胞对化疗药物的敏感性

MDA-MB-231乳腺癌干细胞经两组处理11 d后，MTT法检测结果显示，与对照组相比，观察组丁酸盐二甲双胍能够明显抑制MDA-MB-231细胞增殖（38.2%比83.4%），表明丁酸盐二甲双胍能够增强MDA-MB-231乳腺癌干细胞对化疗药物的敏感性。

图1　超低粘附培养法乳腺癌干细胞

图2　Annexin V/PI双染色法乳腺癌干细胞凋亡情况

3　讨论

乳腺癌作为女性常见恶性肿瘤之一，也是女性病死率最高的肿瘤类型。有报道称，乳腺癌死亡人数占女性恶性肿瘤死亡数的14%［7］。乳腺癌细胞在早期肿瘤细胞就可进入循环系统，并经血行淋巴结，转移至远处；化疗药物治疗能够杀灭肿瘤病灶，降低远处转移发生率，为手术治疗创造良好机会［8-9］。近年来，乳腺癌治疗手段得到不断改进，新型治疗药物及治疗方法也不断更新，但乳腺癌细胞的转移及进展仍无法得到有效控制。过去10余年，分子靶向治疗成为某些肿瘤的一线治疗方案，虽然治疗初期能够有效控制肿瘤细胞生长，但是多数进展性肿瘤患者不可避免地产生化疗、放疗及靶向治疗的抗性，最终导致肿瘤的复发［10］。

乳腺癌干细胞不仅具有癌细胞的特征，还具有自我更新、多向分化、增生前潜能等普通干细胞特性。正常干细胞的自我更新、分化和增殖受调控机制的严格控制，维持体内各组织、器官的稳定性。而肿瘤干细胞具有恶性增殖能力，经过不同形式的自我更新式分裂，产生并扩增具有不同分化表型、独特形态的异质性肿瘤细胞（包括肿瘤干细胞）。此外，肿瘤干细胞高表达的三磷酸腺苷（ATP）结合转运蛋白，利用水解ATP能量，主动转运方式将多种分子从细胞质内转运到细胞外，从而赋予肿瘤干细胞抵抗药物杀伤的能力［11］。乳腺癌干细胞是肿瘤耐药性及肿瘤细胞复发的根源，因此，乳腺癌治疗的理想效果应以根治乳腺癌干细胞为主［12］。传统放化疗不易杀死乳腺癌干细胞，而使其残存下来，易引起肿瘤细胞的复发或转移，故彻底治愈乳腺癌的关键在于靶向消除、杀灭乳腺癌干细胞。

二甲双胍作为临床治疗2型糖尿病的常规药物，通过选择性作用于肝脏，提高肝脏对胰岛素的敏感性，抑制葡萄糖的产生，增加肝外组织对葡萄糖的摄取［13］。有研究证实，二甲双胍还具有降低肿瘤危险，减少肿瘤患者死亡率的作用［14-15］。

目前，而乳腺癌干细胞对化疗药物耐药性高、敏感性差是三阴性乳腺癌的治疗效果较差的主要原因［16］。本研究结果显示，对照组中，丁酸盐二甲双胍能够促进MDA-MB-231细胞凋亡，显著抑制MDA-MB-231细胞增殖，明显增加乳腺癌干细胞对化疗药物的敏感性。可见，丁酸盐二甲双胍能够促进乳腺癌干细胞凋亡，增强乳腺癌干细胞对化疗药物的敏感性，从而增强化疗药物治疗乳腺癌的疗效。

综上所述，乳腺癌干细胞的发现为乳腺癌发病机制的研究开辟了新的方向，随着乳腺癌干细胞致病机制、生物学特征、基因调控机制等研究的不断深入，乳腺癌的发生、发展，以及关键调控点的研究也日趋阐明，靶向乳腺癌干细胞治疗方法也得到了进一步的推进，为彻底解决乳腺癌转移及复发提供了新的空间。丁酸盐二甲双胍充分利用了乳腺癌干细胞的特性，可增强乳腺癌患者对化疗药物的敏感性，提高放化疗治疗的临床疗效，值得临床推广。

［1］唐志柳，白洁，顾丽娜，等.2000-2010年我国前列腺癌和乳腺癌流行状况的系统性综述［J］.中国肿瘤，2013，22（4）：22-23.

［2］Litzenburger BC，Brown PH.Advances in preventive therapy for estrogen receptor negative breast cancer［J］.Curr Breast Cancer Rep，2014，6（2）：96-109.

［3］黄远丽，孙圣荣.二甲双胍联合DE-G方案治疗表皮生长因子受体2阴性乳腺癌35例［J］.中国药业，2015，24（7）：99-100.

［4］侯进，李汾，李新华，等.百合多糖1可增强二甲双胍对乳腺癌细胞的抗增殖作用并促进其凋亡［J］.细胞与分子免疫学杂志，2016，32（6）：780-784.

［5］Wang Y，Wei J，Li L，et al.Combined use of metformin and everolimus is synergistic in the treatment of breast cancer cells［J］. Oncol Res，2015，22（4）：193-201.

［6］Walker EJ，Ko AH，Holly EA，et al.Metformin use among type 2 diabetics and risk of pancreatic cancer in a clinic-based casecontrol study［J］.Int J Cancer，2015，136（6）：E646-E653.

［7］胡杨丽，杨举伦.乳腺癌干细胞的生物学特性与治疗前景［J］.临床与实验病理学杂志，2014，30（3）：298-301.

［8］穆兰，邢芳，肖盟，等.二甲双胍与乳腺癌关系的研究进展［J］.中国肿瘤临床，2014，41（21）：1 413-1 415.

［9］李璞玉，冯笑山.降糖药二甲双胍治疗乳腺癌的研究进展［J］.河南科技大学学报（医学版），2015，33（4）：311-314.

［10］崔畅畅，柯学，吕慧侠.肿瘤干细胞靶向治疗研究进展［J］.药学进展，2016，40（1）：20-29.

［11］刘明明，杨恭.乳腺癌干细胞的研究进展［J］.中国癌症杂志，2013，23（8）：624-631.

［12］姚慧，邓雪瑜，方秦，等.洛伐他汀对乳腺癌干细胞的体外化疗增敏作用［J］.湖南师范大学学报（医学版），2015，12（5）：1-3.

［13］Al Hilli MM，Bakkum-Gamez JN，Mariani A，et al.The effect of diabetes and metformin on clinical outcomes is negligible in risk-adjusted endometrial cancer cohorts［J］.Gynecol Oncol，2016，140（2）：270-276.

［14］冯铎，陈天文，陶霖玉，等.二甲双胍对人HER2阳性乳腺癌细胞增殖与凋亡的影响［J］.中国现代医学杂志，2012，22（18）：37-40.

［15］陈旭，沈宇辉，张伟滨.二甲双胍抗肿瘤效应及其机制的研究进展［J］.诊断学理论与实践，2015，14（3）：270-274.

［16］谢锦华，刘地发.二甲双胍联合CEF方案与单纯CEF方案在乳腺癌新辅助化疗中的疗效比较［J］.实用癌症杂志，2011，26（1）：92-93.

The Enhancement of Anti-Tumor Activity and Cytotoxicity on Breast Cancer Stem Cells by M etformin Hydrochloride

Wang Wenrong
（Jingzhou Third People′s Hospital，Jingzhou，Hubei，China434000）

ObjectiveTo study the enhancement of anti-tumor activity and cytotoxicity of metformin hydrochloride on breast cancer stem cells.M ethodsThe breast cancer stem cells were obtained by ultra-low adherence suspension culture from MDA-MB-231 cells.The breast cancer stem cells were randomized into the control group（doxorubicin）and the observation group（metformin hydrochloride combined with doxorubicin）.The cells were controlled under hypoxia.The cell apoptosis in two groups was detected by flow cytometry.The proliferation of breast cancer stem cells was assayed by MTT measurement.ResultsIn the control group，the treatment of metformin hydrochloride could promote the cell apoptosis of MDA-MB-231 without obvious effect on ER-positive MCF-7；in the observation group，the treatment of metformin hydrochloride could significantly increase the sensitivity of breast cancer stem cells to chemotherapy drug.ConclusionMetformin hydrochloride can promote the apoptosis of breast cancer stem cells and increase the sensitivity of breast cancer stem cells to chemotherapy drug.

metformin hydrochloride；breast cancer stem cells；cell apoptosis；cell proliferation

R965；R977.1+5；R737.0

A

1006-4931（2016）17-0035-03

王文蓉（1979-），女，大学本科，主治医师，研究方向为妇产科，（电子信箱）wangwenrong123ww@ sina.com。

（2016-04-25；

2016-05-13）