表面增强拉曼光谱检测牛奶中三聚氰胺

王琳，王雪，田静秒，朱华

（北京普析通用仪器有限责任公司，北京101200）

表面增强拉曼光谱检测牛奶中三聚氰胺

王琳，王雪，田静秒，朱华

（北京普析通用仪器有限责任公司，北京101200）

建立一种用于检测三聚氰胺的快速分析方法。采用表面增强拉曼光谱（SERS）分析方法检测三聚氰胺。该方法的方法检测限为50ng/mL。该方法的检测结果受pH的影响，在酸性条件下，三聚氰胺的表面增强拉曼效应较显著。该方法可以用于检测牛奶中的三聚氰胺，检测限为1μg/mL。该方法操作简便，所用时间短，牛奶前处理与检测时间一共只需5min，适合现场快速筛查。

表面增强拉曼光谱；三聚氰胺；牛奶

表面增强拉曼光谱技术（SERS）是拉曼光谱技术中的一种，它发展于20世纪70年代。吸附在粗糙化金属表面的化合物，由于表面局域等离子激元被激发所引起的电磁增强，以及粗糙表面上的原子簇及吸附其上的分子构成拉曼增强的活性点，这两者的作用使被测定物的拉曼散射产生极大的增强效应。其增强因子可达103～107，已发现能产生SERS的金属有金、银等少数金属。此技术具有选择性好和灵敏度高的优点，实际检测限可达10-12克级。因此，SERS技术作为一种新兴的定性与定量检测技术，近年来引起了极大的重视，取得了若干研究进展［1-3］。

三聚氰胺简称三胺，学名三氨三嗪，别名蜜胺、氰尿酰胺、三聚氰酰胺。三聚氰胺（Melamine）是一种重要的氮杂环有机化工原料，是尿素后加工产品［4］。它是白色单斜晶体，具有D3h对称性［5］。三聚氰胺具有较强的黏性，在机体内的代谢属于不活泼代谢或惰性代谢［6］，容易在体内吸附形成结石的草酸、鞣酸及钙等物质，并沉积在泌尿系统中。长期摄入三聚氰胺会造成泌尿系统损害，引起膀胱及肾的结石，并可进一步引起移行性细胞增生进而诱发膀胱癌［7］。乳制品是婴幼儿的主要食物来源，婴幼儿代谢能力弱，所以长期食用含有三聚氰胺的食物就会对身体造成危害甚至威胁生命安全。2008年我国发生被三聚氰胺污染的乳制品导致婴幼儿结石及数起婴幼儿死亡病例。

综上，由于三聚氰胺威胁健康，因此禁止被添加到食物中。但是，因为食品工业上普遍采用的、被定为国家标准的检测生鲜奶蛋白质含量的方法是凯氏定氮法［8］，凯氏定氮法并不是直接检测蛋白质含量，而是通过测氮含量来推算蛋白质含量。三聚氰胺含氮量高达66%左右，将其混入掺水或劣质生鲜奶中，就可以造成检测样品中蛋白质含量达标的假象。因此，不法商家仍然会在牛奶中添加三聚氰胺以牟取利益，因此研究牛奶中三聚氰胺的快速准确的检测方法十分必要。

表面增强拉曼光谱法检测牛奶中非法添加三聚氰胺具有操作简单，快速和高灵敏度的优点，本文采用胶体金颗粒作为表面增强拉曼光谱的增强试剂，研究了采用SERS技术检测牛奶中非法添加的三聚氰胺的可行性，为进一步研究SERS技术在食品安全领域的应用奠定了基础。

1　材料与方法

1.1仪器

手持式拉曼光谱检测仪（IDRaman mini）（激发光波长785nm，激光输出功率100mW，光谱范围400cm-1～2 300 cm-1，光谱分辨率12 cm-1～14 cm-1）：购于海洋光学公司。

1.2材料与试剂

三聚氰胺标准品：购于中国兽药研究所；氯金酸、柠檬酸三钠：购于北京科实玻璃仪器有限公司；其他试剂：购于西陇化工股份有限公司。

1.3胶体金制备

采用柠檬酸三钠还原氯金酸的方法制备胶体金溶液［9］，配制100 mL质量分数为0.02%的氯金酸溶液，边搅拌边加热至沸腾，快速加入3 mL的柠檬酸三钠溶液，观察溶液颜色变化，溶液颜色完全变为红色后开始计时，5 min后停止加热，使其缓慢冷却至室温，加超纯水补足体积至100 mL。

1.4表面增强拉曼光谱检测步骤

首先，检测待测分子标准品的拉曼图谱，以该图谱作为标准图谱；接着，将40 μL样品与360 μL增强试剂（胶体金颗粒溶液）放入样品瓶中，混合，摇匀；再将样品瓶放入拉曼检测仪的样品池中，获取样品的拉曼图谱，将样品的拉曼图谱与标准图谱对比，以能否观察到特征峰作为能否检出的判断依据。

手持式拉曼光谱检测仪的操作步骤：1）确认仪器中已放入电池，或已连接外接取电设备（如电脑），并且样品池中没有样品瓶，再按下开机按钮启动仪器。进入密码输入界面，输入四位数字密码，按确认键。等待仪器自检结束，进入检测界面。2）将样品瓶放入样品池，或将探头对准待测样品，按下确认键，再按下运行键，接着再按下确认键，等待仪器获得样品的拉曼图谱。3）结果界面显示红色的样品图谱，按下结果界面左下方的储存键，将样品的拉曼图谱储存到仪器中。拉曼图谱的存储名称为检测时间的小时-分钟-秒钟，存储位置为“SPECTRA”文件夹中检测日期的文件夹。4）将仪器连接电脑，按下USB键，打开“SPECTRA”文件夹，将需要的数据导出。

1.5研究pH对SERS检测三聚氰胺的影响

取胶体金溶液，不加入三聚氰胺，将pH调节到2.0，7.0或12.0，之后按照1.4的方法进行检测。

使用去离子水溶解三聚氰胺，配制质量浓度为50 ng/mL的三聚氰胺溶液，将三聚氰胺溶液与胶体金溶液按照体积比1∶9的比例混合均匀，将pH调节到2.0，7.0或12.0，之后按照1.4的方法进行检测。

1.6研究SERS检测牛奶中三聚氰胺的方法

取0.5 mL牛奶，加入0.5 mL去离子水，混匀。加入25μL的样品前处理试剂Ⅰ（106 g/L亚铁氰化钾溶液）与25μL的样品前处理试剂Ⅱ（220 g/L乙酸锌溶液），混匀，涡旋振荡30 s至1 min。14 000 r/min离心1 min，取中间清液，使用0.45 μm的滤膜过滤。取过滤后的溶液，与胶体金溶液按照体积比1∶9的比例混合均匀，按照1.4的方法进行检测。

2　结果与分析

2.1pH对SERS检测三聚氰胺的影响

胶体金溶液的拉曼图谱见图1（a），三聚氰胺的拉曼图谱见图1（b）。

图1　胶体金与三聚氰胺的拉曼图谱Fig.1Raman atlas of colloidal gold and SERS atlas of melamine

由图1可见，检测时调节pH至酸性，可以观察到三聚氰胺的拉曼特征峰，波数为710 cm-1，由676 cm-1的峰发生红移而至。推测该峰来自于三聚氰胺分子的对称骨架伸缩振动［10］。检测时pH值为中性或碱性，则无法观察到上述特征峰。说明调节pH值至酸性，能够引起或促进胶体金对拉曼光谱的增强效应。

三聚氰胺的表面增强图谱，与三聚氰胺的标准图谱有区别，984 cm-1特征峰消失，676 cm-1特征峰红移至710 cm-1。推测三聚氰胺与胶体金颗粒表面发生相互作用，拉曼振动模式有所改变，因此特征峰发生位移或其他变化。

酸性条件下，三聚氰胺的表面增强拉曼效应较显著。胶体金对待测分子拉曼散射的增强机制，与化学键效应（来自于吸附分子与金属的复合、成键）有关，也与电荷转移效应有关。推测溶液pH变为酸性，影响了三聚氰胺的电性与电荷分布，从而影响了三聚氰胺与胶体金颗粒表面的吸附基团或吸附模式，以及三聚氰胺与胶体金颗粒的拉曼共振效应，因此使胶体金颗粒对三聚氰胺拉曼散射的表面增强作用进一步加强。碱性条件影响不显著。

本方法检测三聚氰胺的检测限为50 ng/mL。

2.2检测牛奶中的三聚氰胺

市售牛奶，添加不同质量浓度的三聚氰胺，检测结果见图2。

图2　牛奶中三聚氰胺的拉曼图谱Fig.2SERS atlas of melamine in milk

由图2可见，牛奶中添加三聚氰胺的质量浓度为1、2、5 μg/mL，可以观察到三聚氰胺的拉曼特征峰，波数为710 cm-1。说明该方法可以检测牛奶中非法添加的三聚氰胺。

本方法检测牛奶中的三聚氰胺，检测限为1μg/mL。

3　讨论

三聚氰胺对生物有重大危害，被三聚氰胺污染的饲料可以导致宠物猫、狗中毒死亡，被三聚氰胺污染的婴幼儿食品可以导致婴幼儿肾结石，因此，开发能够准确迅速的检测三聚氰胺的方法有重要意义。本研究建立了SERS检测三聚氰胺的高灵敏方法，方法检测限为50 ng/mL。本研究还建立了SERS检测牛奶中三聚氰胺的方法，检测限为1 μg/mL，该方法操作简便，所用时间短，牛奶前处理与检测时间一共只需5 min，试剂稳定，配合手持式或便携式拉曼光谱仪，适合现场快速筛查。

本文通过研究pH对SERS检测结果的影响，发现酸性条件下，三聚氰胺的表面增强拉曼效应较显著，这一研究结果，为进一步研究表面增强拉曼分析的原理与检测效果奠定了基础。

［1］EnricaDroghetti，Francesco P Nicoletti，Luca Guandalini，et al.SERS detection of benzophenones on viologen functionalized Ag nanoparticles：application to breakfast cereals［J］.Journal of Raman Spectroscopy，2013，44（10）：1428-1434

［2］Irene Izquierdo-Lorenzo，José Vicente García-Ramos，Santiago Sanchez-Cortes.Vibrational characterization and surfaceenhancedRaman scattering detection ofprobenecid doping drug［J］.Journal of Raman Spectroscopy，2013，44（10）：1422-1427

［3］Benjamin Saute，Radha Narayanan.Solution-based SERS method to detectdithiocarbamate fungicides in differentreal-world matrices［J］. Journal of Raman Spectroscopy，2013，44（11）：1518-1522

［4］谢荣国，武晓宏，杨俊华.饲料中三聚氰胺检测及其危害［J］.饲料广角，2008（9）：20-22

［5］马红安，赵永年.三聚氰胺（C3N6H6）的高压Raman与压致结构相变研究［J］.光散射学报，2005，16（4）：289-294

［6］王锭笙，李学铭，张鹏翔，等.亚单分子层三聚氰胺的便携式拉曼检测［J］.光散射学报，2008，20（4）：379-383

［7］佘永新，柳江英，吕晓玲，等.三聚氰胺的毒性及其危害［J］.食品与药品，2009，11（3）：71-74

［8］中华人民共和国卫生部.GB 5009.5-2010食品安全国家标准食品中蛋白质的测定［S］.北京：中国标准出版社，2010

［9］Frens G.Preparation gold dispersions of varying particle size：controlled nucleation for the regulation of the particle size in monodisperse gold solutions［J］.Nature Physical Science，1973，241（17）：20-22

［10］朱自莹，顾仁敖，陆天虹.拉曼光谱在化学中的应用［M］.沈阳：东北大学出版社，1998：300

Surface Enhanced Raman Spectroscopy（SERS）Assay Method for Melamine in Milk

WANG Lin，WANG Xue，TIAN Jing-miao，ZHU Hua
（Beijing Purkinje General Instrument CO.，LTD.，Beijing 101200，China）

A fast surface enhanced Raman spectroscopy（SERS）assay method for melamine was developed. The limit of detection of the SERS method was 50 ng/mL.The SERS spectrums under three different pH conditions were studied，and the results showed that the pH of the system had obvious effect on the SERS，and the SERS was most enhanced under acidic condition.For detecting milk，the limit of detection of the SERS method was 1 μg/mL.The SERS method was simple and rapid and could be finished in five minutes.The SERS method could be a convenient tool for field detection of melamine.

surface enhanced Raman spectroscopy（SERS）；melamine；milk

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.20.038

王琳（1980—），男（汉），工程师，硕士，研究方向：快速诊断检测技术的研究开发和应用等。

2015-11-25