豆粕中大豆异黄酮含量快速测定方法的研究

鲍会梅

（江苏食品药品职业技术学院食品学院，江苏淮安223003）

豆粕中大豆异黄酮含量快速测定方法的研究

鲍会梅

（江苏食品药品职业技术学院食品学院，江苏淮安223003）

探究豆粕中大豆异黄酮测定的最优方法。使用高效液相色谱法测定豆粕中大豆苷、大豆苷元、染料木素3种大豆异黄酮的含量并优化其检测条件。结果表明，大豆苷、大豆苷元、染料木素含量分别为194.92、14.20、15.42μg/g；RSD都小于0.30%；大豆苷、大豆苷元、染料木素的平均回收率分别为99.55%、99.65%、99.11%，检测时，流动相为甲醇∶水∶醋酸（40∶60∶1，体积比）；柱温为40℃；流速为1.0mL/min。

大豆异黄酮；豆粕；高效液相色谱法

豆粕是大豆油生产工业的副产品，豆粕中含有大量大豆异黄酮，大豆异黄酮是苯丙烷类代谢途径的一种次生代谢产物［1］，目前发现的大豆中异黄酮包括游离型苷元和结合型的糖苷两类12种，包括大豆苷（daidzin）、大豆苷元（daidzein）、染料木素（genistein）［2］。

大量研究表明，大豆异黄酮与人类健康密切相关，具有弱雌激素活性、抗氧化活性、抗溶血活性和抗真菌活性，能有效地预防和抑制白血病、骨质疏松、结肠癌、肺癌、胃癌、妇女更年期综合症等多种疾病的发生，尤其是对乳腺癌和前列腺癌有积极的预防和治疗作用［3］，大豆异黄酮因具有如此多的生物学活性而越来越受到社会和学术界的关注，是近年来研究的热点［4］。大豆异黄酮的测定方法有多种，目前主要有高效液相色谱法、紫外薄层色谱法、分光光度法、气相色谱法等［5］，其中高效液相色谱法是测定大豆异黄酮研究工作中应用最为广泛的一种方法［6］。

采用高效液相色谱法对豆粕中提取出来的大豆苷、大豆苷元、染料木素进行测定，并且通过探讨其检测条件，证明该法是一种简便、快速、准确、分离效果更好的分析方法。

1　材料与方法

1.1仪器与设备

1.1.1仪器

LC-10AT高效液相色谱仪（日本岛津公司），色谱系统包括：Waters600泵；Waters600控制器、光电二极管阵列检测器（Waters2487photodi-odeArravDeteetor）；在线脱气机（Waters In-lineDegasserAF）；Millcnniuln卫色谱工作站。

1.1.2色谱条件

色谱柱：Waters Symmetry Columns Symmetry ShieldTM RP18（5 μm，3.91×150 mm）；流动相∶甲醇∶水∶醋酸=40∶60∶1（体积比）；柱温：40℃；流速：1.0 mL/min；进样量：10 μL；检测波长：259 nm。

1.2试剂与材料

试剂：3种大豆异黄酮标准品大豆苷（daidzin）、大豆苷元（daidzein）、染料木素（genistein）；甲醇为色谱纯；超纯水自制；乙醇、丙酮等样品制备用试剂均为分析纯；标准储备液（1.00 mg/mL）；混合标准溶液的配制（100 μg/mL）。

原料：豆粕购于淮安城南农贸市场。

1.3试验步骤

1.3.1样品处理

称取脱脂大豆粕100 g，70℃水浴浸提3 h，乙醇浸提液减压浓缩，用4 moL/L HCl等电点沉降离心除蛋白，浓缩液稀释到一定浓度，过大孔树脂吸附解吸，解吸液浓缩后用丙酮萃取，萃取液浓缩干燥成粉末。准确称取1.000 0 g上述方法得到的粉末，转至50 mL容量瓶中，加入色谱甲醇接近刻度，常温超声波处理30 min，取出，用甲醇定容摇匀，取样品溶液25 mL置于离心管中，离心20 min（转速3 000 r/min），取上清液滤膜过滤，收集滤液备用。

1.3.2标准曲线的绘制

准确移取0.00、4.00、8.00、12.00、16.00、20.00、24.00 mL的混合标准溶液分别注入100 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，混匀（配制成0、4、8、12、16、20、24 μg的大豆苷、大豆苷元、染料木素）混合标准系列溶液，经0.5 μm滤膜过滤后，分别用微量进样器进样，将配制的系列标准液注入高效液相色谱分离。从低浓度到高浓度依次进样，以峰面积Y作因变量，分别以3种标准品系列浓度X（μg/mL）作自变量，绘制标准曲线。

1.3.3样品的测定

在优化色谱条件下，吸取标准品和样品供试液各10 μL注入高效液相色谱仪进行分离，以其标准溶液峰的保留时间进行定性，利用峰面积求出样液中待测物质的含量。

1.3.4结果计算

式中：X为样品中大豆苷/大豆苷元/染料木素的含量，μg/g；A1为样品峰面积；ρ为标准溶液浓度，μg/mL；A2为标准溶液峰面积；V为样品定容体积，mL；m为试样质量g。

2　高效液相色谱法检测条件的研究

2.1流动相的选择

流动相是色谱条件中最重要的一项，通过对流动相比例的选择来达到最适的分析时间和最佳的分离效果。在流动相比例分别为甲醇∶水（体积比）=25∶75、30∶70、35∶65、40∶60、45∶55、50∶50时，对混合大豆异黄酮的标准液进行液相色谱测定，选择最佳流动相比例［7］。

2.2流动相pH值对保留时间的影响

选择最佳流动相比例甲醇∶水（体积比）=40∶60时，酸度的变化能够调节流动相的pH值，本试验选用醋酸进行研究，通过分析不同比例的甲醇∶水∶醋酸（体积比）=40∶60∶0、40∶60∶0.5、40∶60∶1、40∶60∶1.5、40∶60∶2、40∶60∶2.5所对应的pH值对大豆异黄酮标准品进行分离时间的比较，最终选出最佳比例。

2.3柱温的选择

柱温对大豆异黄酮成分的保留值以及分离度都有影响。比较了恒流速1 mL/min时，30、35、40、45、50、55℃6种温度条件下3种大豆异黄酮成分的保留时间，选择最佳的温度［8］。

2.4线性关系和检出值

在上述的优化条件下，取不同浓度0、4、8、12、16、20、24 μg/mL的标准溶液，平行测定6次得一组低浓度标准峰面积，求出其标准偏差，3倍标准偏差除以方法的灵敏度，即得方法的最低检出浓度，得到回归方程、线性相关系数、线性范围和检出限。

2.5流速的选择

流速大小直接影响色谱柱及其各成分的分离效果，不同的流速对大豆异黄酮保留时间会有影响。选取0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 mL/min对样品标准使用液进行液相色谱测定，选取最佳流速。

3　结果与讨论

3.1标准工作曲线的建立

根据上述试验1.3.4，得出大豆苷、大豆苷元、染料木素3种大豆异黄酮与各自峰面积的关系，结果见表1、2、3和图1。

表1　大豆苷进样浓度与峰面积的关系Table 1Relationship between sample concentration and peak area of soybean

表2　大豆苷元进样浓度与峰面积的关系Table 2The relationship between the sample concentration and the peak area of soybean

表3　染料木素进样浓度与峰面积的关系Table 3Relationship between sample concentration and peak area of Genistein

图1　3种大豆异黄酮进样浓度与峰面积的标准曲线图Fig.1The standard curve of the sample concentration and peak area of 3 kinds of soybean isoflavone

由图1可以得到，大豆苷的标准曲线方程为y= 36 672x-4 059.7，相关系数R2=0.999 2；大豆苷元的标准曲线方程为y=47 945x-19 107，相关系数R2=0.9985；染料木素的标准曲线方程为y=65 322x-44 982，相关系数R2=0.994 8。根据公式（1）可得样品中大豆苷、大豆苷元、染料木素的含量分别为194.92、14.20、15.42 μg/g。

3.2精密度试验

精密吸取10 μL稀释后的混合标准品溶液，在上述色谱条件下连续进样6次，分析测定3种大豆异黄酮组分的峰面积，并记录保留时间，进行统计分析变异系数，结果见表4。

表4　3种大豆异黄酮的精密度Table 4The precision of 3 kinds of soybean isoflavone

从表4中可以看出，大豆苷的保留时间和峰面积的变异系数分别为0.21、0.20%，大豆苷元的保留时间和峰面积的变异系数分别为0.21、0.20%，染料木素的保留时间和峰面积的变异系数分别为0.15、1.89%，3种大豆异黄酮的保留时间和峰面积的变异系数均小于0.30%，表明本试验建立的色谱条件合理，方法精密度良好。

3.3加标样品回收率

分别精密量取混合标准品溶液4、8、12、16、20、24 μg/mL加入到已得浓度的样品液中，按上述色谱条件进行分析，每个样品平行进样6次测定峰面积，计算平均值，根据外标曲线计算加样回收率，结果见表5。

表5　3种大豆异黄酮加样回收率结果Table 5Results of recovery rate of 3 kinds of Soybean Isoflavones

续表5　3种大豆异黄酮加样回收率结果Continue table 5Results of recovery rate of 3 kinds of Soybean Isoflavones

由表5可知，测定的大豆苷、大豆苷元、染料木素的平均回收率分别为99.55%、99.65%、99.11%，表明该方法准确度高。

根据高效液相色谱法测定大豆苷、大豆苷元、染料木素，其保留时间和峰面积的变异系数均小于0.30%，回收率分别为99.55%、99.65%、99.11%，在国标范围内，所以本文选用高效液相色谱法来测定大豆异黄酮。

3.4检测条件的选择

3.4.1流动相比例的选择

经分别选用甲醇∶水（体积比）的比例为25∶75、30∶70、35∶65，40∶60、45∶55、50∶50，结果见表6。

表6　流动相比例对试验结果的影响Table 6Effect of flow rate on the experimental results

由表6可看出，随着甲醇含量的变化，其分离效果改变，当甲醇∶水（体积比）=40∶60时，不仅分离良好、峰形美观，无拖尾，且分析所用的时间较短。故选择流动相的比例为甲醇∶水（体积比）=40∶60。

3.4.2流动相pH值对保留时间的影响

分别配制40∶60∶0、40∶60∶0.5、40∶60∶1、40∶60∶ 1.5、40∶60∶2、40∶60∶2.5（体积比）的流动相，结果见表7。

表7　不同流动相比例、pH值及保留时间Table 7The proportion of different mobile phase，pH value and retention time

由表7可以看出，以醋酸调节流动相pH值，pH值越小，分离时间越短，当流动相甲醇∶水∶醋酸（体积比）=40∶60∶1时，由于醋酸为弱酸，它的含量对pH值影响不大，又考虑到酸对色谱柱的影响，所以，当pH值为3.15时，分离效果较好。

3.4.3柱温的选择

选择温度分别为30、35、40、45、50、55℃下进行试验探讨，具体方法见2.3，结果见表8。

表8　不同柱温条件下3种异黄酮保留时间Table 8Retention time of 3 kinds of isoflavones under different temperature conditions

表8表明，随着柱温温度的升高，3种大豆异黄酮的保留时间越短，保留时间越短越好，但为了能够避免较高柱温，本试验研究选择温度为40℃。

3.4.4线性关系与检出限

根据2.4以平行测定6次得一组低浓度标准峰面积，求出其标准偏差，3倍标准偏差除以方法的灵敏度，即得方法的最低检出浓度，检出限以结果见表9。

表9　回归方程、相关系数、线性范围和检出限Table 9Regression equation，correlation coefficient，linear range and detection limit

由表9可知，结果表明3种大豆异黄酮在各线性范围内线性关系良好。

3.4.5流速的选择

根据2.5试验，结果发现在0.6、0.8 mL/min流速较慢分离完全，但保留时间较长，峰形较差，在1.2、1.4、1.6 mL/min的流速时虽能缩短分析时间，但部分化合物的分离度不佳，为保证分离完全，又缩短保留值时间，确保峰形美观，流速调节到1.0 mL/min较为合适。

4　结论

采用高效液相色谱法用于测定豆粕中大豆苷、大豆苷元、染料木素3种大豆异黄酮的含量，含量分别为194.92、14.20、15.42 μg/g。高效液相色谱法的RSD均小于0.30%，平均回收率分别为99.55%、99.65%、99.11%，所以本文选择高效液相色谱法是可靠的。

采用高效液相色谱法快速测定豆粕中大豆苷、大豆苷元、染料木素3种大豆异黄酮的含量，通过对检测条件进行试验最佳结果的探讨，最终得出以下结论：随着甲醇含量的变化，其分离效果也改变，当甲醇∶水（体积比）=40∶60时，流动相中pH值对保留时间有影响，醋酸能够调节流动相pH值，pH值越小，分离时间越短，最终确定流动相为甲醇∶水∶醋酸（体积比）=40∶60∶1，此时峰分离良好、峰形美观，无拖尾，且分析所用的时间较短；为了能够避免较高柱温，在柱温40℃下，3种大豆异黄酮保留时间较短；以平行测定得一组低浓度标准峰面积，求出其标准偏差，3倍标准偏差除以方法的灵敏度，即得方法的最低检出浓度，结果表明3种大豆异黄酮在各线性范围内线性关系良好；为保证分离完全，确保峰形美观，又能缩短保留值时间，以1.0 mL/min为最佳流速。

［1］张艳，李晓薇，张海军，等.大豆异黄酮提取—测定优化体系的建立［J］.大豆科学，2011，30（1）：141-143

［2］王爱月，翟志雷，卢素格.高效液相色谱法测定保健食品中大豆异黄酮含量的方法改进［J］.中国卫生工程学，2012，12（6）：503-506

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［4］蔡立，郁建平，占建波.豆粕中大豆异黄酮提取纯化工艺研究［J］.食品科学，2008，29（4）：185

［5］许晶，孙艳梅，张永忠.高效液相色谱法快速测定大豆异黄酮制品中有效成分的研究［J］.食品工业科技，2008，29（3）：280-285

［6］高荣海，李长彪，孟宪文，等.高效液相色谱法测定豆粕中异黄酮含量的研究［J］.食品科技，2006（10）：234-237

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Soybean Isoflavone Content in Soybean Meal Fast Determination Method of Research

BAO Hui-mei
（School of Food，Jiangsu Food&Pharmaceutical Science College，Huai'an 223003，Jiangsu，China）

To explorethe optimal methods of soybean isoflavones determination of soybean meal in objective，the use of HPLC determination of 3 Soybean Isoflavones of daidzin，daidzein，genistein in soybean meal and optimize the detection conditions.daidzin，daidzein，genistein content were 194.92，14.20，15.42 μg/g；RSD were less than 0.30%；the average recovery of daidzin，daidzein，genistein was respectively 99.55%，99.65%，99.11%，detection，mobile phase of methanol∶water∶acetic acid（40∶60∶1，volume ratio）；column temperature was 40℃；the flow rate was 1.0 mL/min.

soy isoflavones；soybean meal；high performance liquid chromatography

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.20.035

鲍会梅（1974—），女（汉），副教授，硕士，主要从事食品理化检验教学工作。

2015-11-21