酶制剂法解决红茅烧酒沉淀问题的研究

谢军，罗惠波，*，黄治国，卫春会，宗绪岩，叶慧敏

（1.四川理工学院生物工程学院，四川自贡643000；2.酿酒生物技术及应用四川省重点实验室，四川自贡643000）

酶制剂法解决红茅烧酒沉淀问题的研究

谢军1，2，罗惠波1，2，*，黄治国1，2，卫春会1，2，宗绪岩1，2，叶慧敏1

（1.四川理工学院生物工程学院，四川自贡643000；2.酿酒生物技术及应用四川省重点实验室，四川自贡643000）

针对红茅烧酒浑浊、沉淀的问题，采用酶制剂澄清法，通过单因素试验、正交试验及验证试验进行探究，结果表明：以支链淀粉酶0.0065%、中性蛋白酶0.0055%、单宁酶0.0055%组合使用澄清效果最好，是解决红茅烧酒沉淀问题的一种有效方法。

红茅烧酒；沉淀；酶制剂；澄清

红茅烧酒源自古时名酒“鹅黄名酿”，是一种独特工艺酿造的小曲酒，其基于清香纯正的小曲高粱基酒，通过浸泡糖化后的本地糯红高粱吸收了高粱的色泽、淀粉、氨基酸等物质，酒体呈现出高粱的本色，金红透亮，正如宋代诗人陆游酒诗所说“鹅黄名酿何由得，且醉杯中琥珀红”［1］。国家著名酿酒专家胡永松教授也曾对红茅烧坊给予了高度评价“红茅烧坊既具有原来蒸馏酒的特点，又将糖化发酵酒的香味成份通过蒸馏透析出来，应该说很有特色。它的出世对川酒乃至中国白酒的多样化发展都有一定的影响，它增加了川酒的多样性”［2］，堪称小曲酒当中的典范。

同当前小曲酒普遍存在着由于降度、光照及温度变化而产生沉淀的问题［3］一样，红茅烧酒由于其独特的生产工艺特点，产品在货架期也出现了严重的沉淀现象，严重影响了产品的感官和口感，这是一个亟待解决的问题，而该问题的研究在整个行业内还是一片空白。本文在前期分析研究［4-13］的基础上从酿造工艺入手以期探究出一种能彻底解决红茅烧酒沉淀问题的方案。红茅烧酒不同于一般的中国白酒，它是中国白酒当中的唯一一款“红酒”，深入研究它将有助于补充小曲酒的种类，丰富中国白酒的种类使中国白酒更早一步进入世界酒市场。

1　材料与方法

1.1材料

本地糯红高粱、优质小曲白酒：取自自贡市红茅烧酒业有限公司。

1.2主要试剂及设备

1.2.1主要试剂

糖化酶（50 000 U/g）、单宁酶（500 U/g）：食品级，仰韶生物化工有限公司；支链淀粉酶（200 000 U/g）、中性蛋白酶（80 000 U/g）：食品级，北京金路鸿生物技术有限公司。

1.2.2主要仪器及设备

BSM电子分析天平：北京赛多利斯天平有限公司；HH-8数显恒温水浴锅：国华电器有限公司；5424R高速离心机：德国Eppendorf公司。

1.3方法

1.3.1工艺流程

红茅烧酒主要工艺流程见图1［14］。

图1　红茅烧酒主要工艺流程图Fig.1The main technological process of Hongmaoshao liquor

红茅烧酒酿造过程中，糖化后的糯红高粱中丰富的淀粉、单宁、蛋白质等大分子物质通过浸泡工艺融入到酒中，这些大分子物质在储存期及货架期中受到外界环境（温度、光照等）的影响不断的聚集然后形成大片沉淀［15］，因此从酿造工艺入手，分别以支链淀粉酶、中性蛋白酶、单宁酶与蒸煮后的糯红高粱在适宜温度下拌合，用优质小曲基酒浸泡4个月后过滤，静置一年后观察沉淀量。

1.3.2支链淀粉酶最佳用量的确定

取未粉碎的高粱720 g，将水烧至沸腾倒入高粱中至高过粮面10 cm，控制水温在70℃左右，维持7 h，泡至高粱易掐碎、无生芯，过滤；开始蒸粮，初蒸圆汽后，维持22 min后加沸水至没过粮面继续蒸至圆汽关火闷粮，至90%以上高粱破裂后滤去多余水分，复蒸1 h，至高粱糊而不烂，内无生芯，表皮吸汗，黏度正常即可［16］。冷却至40℃左右，先按高粱干重的0.005 0%加入糖化酶、单宁酶、中性蛋白酶，再按高粱干重的0.004 0%、0.004 5%、0.005 0%、0.005 5%、0.006 0%、0.006 5%、0.007 0%加入支链淀粉酶，拌匀。在坛底撒上一层蒸过的糠壳，将拌匀的高粱倒入其中，在表面撒一层蒸过的糠壳，插入温度计，封好保鲜膜，糖化22 h，糖化后优质小曲基酒与高粱按质量比20∶7的比例浸泡4个月，过滤、静置陈放一年后离心、烘干沉淀，测定沉淀量，每组3个平行。

1.3.3中性蛋白酶最佳用量的确定

按上述泡粮和蒸粮工艺，出锅后冷却至40℃左右，先按高粱干重的0.005 0%加入糖化酶、单宁酶、支链淀粉酶，再按高粱干重的0.004 0%、0.004 5%、 0.005 0%、0.005 5%、0.006 0%、0.006 5%、0.007 0%加入中性蛋白酶，后续工艺同1.3.2，每组3个平行。

1.3.4单宁酶最佳用量的测定

按上述泡粮和蒸粮工艺，出锅后冷却至40℃，先按高粱干重的0.005 0%的比例加入支链淀粉酶、糖化酶、中性蛋白酶，再按高粱干重的0.004 0%、0.004 5%、0.005 0%、0.005 5%、0.006 0%、0.006 5%、0.007 0%加入单宁酶，后续工艺同1.3.2，每组3个平行。

1.3.5确定3种酶最优组合比例的正交试验

根据单因素试验结果，按上述试验方法采用L9（34）正交表对支链淀粉酶、中性蛋白酶和单宁酶的组合比例进行优化，正交试验因素水平见表1。

表1　正交试验因素水平Table 1The factors and levels in the orthogonal experiment

1.3.6验证试验

为了验证正交试验的结果是否为最优，以不加酶处理的样品作为对照组、以3种酶的最适用量、正交试验中结果最好的条件、正交试验得出的最优条件作为试验组，比较它们对红茅烧酒沉淀量的影响，以确定解决红茅烧酒沉淀问题的最优条件。

2　结果与分析

2.1支链淀粉酶最佳用量的确定

支链淀粉酶用量与红茅烧酒沉淀之间的关系见图2。

图2　支链淀粉酶用量与红茅烧酒沉淀之间的关系Fig.2The relationship between pullulanase dosage and the precipitation of Hongmaoshao liquor

本试验研究了支链淀粉酶的用量对红茅烧酒沉淀量的影响，结果表明：随着支链淀粉酶用量的增加，沉淀量随之减少，当支链淀粉酶用量≥0.006 0%时沉淀量趋于稳定，且相互之间不具有显著差异，结合经济原则最终确定支链淀粉酶的最佳用量为0.006 0%。

2.2中性蛋白酶最佳用量的确定

中性蛋白酶用量与红茅烧酒沉淀之间的关系见图3。

图3　中性蛋白酶用量与红茅烧酒沉淀之间的关系Fig.3The relationship between neutral protease dosage and the precipitation of Hongmaoshao liquor

本试验研究了中性蛋白酶的用量对红茅烧酒沉淀量的影响，结果表明：随着中性蛋白酶用量的增加，沉淀量随之减少，当中性蛋白酶用量≥0.005 0%时沉淀量趋于稳定，且相互之间不具有显著差异，结合经济原则最终确定中性蛋白酶的最佳用量为0.005 0%。

2.3单宁酶最佳用量的测定

单宁酶用量与红茅烧酒沉淀之间的关系见图4。

图4　单宁酶用量与红茅烧酒沉淀之间的关系Fig.4The relationship between Tannase dosage and the precipitation of Hongmaoshao liquor

本试验研究了单宁酶的用量对红茅烧酒沉淀量的影响，结果表明：随着单宁酶用量的增加，沉淀量随之减少，当单宁酶用量≥0.006 0%时沉淀量趋于稳定，且相互之间不具有显著差异，结合经济原则最终确定单宁酶的最佳用量为0.006 0%。

2.4正交试验结果

根据单因素试验结果，进行正交试验，正交试验结果见表2、表3。

表2　正交试验结果Table 2Results of the orthogonal experiment

表3　方差分析结果Table 3The results of variance analysis

试验结果表明：各因素对红茅烧酒沉淀量的影响程度依次为A3＞B3＞C1，即支链淀粉酶＞中性蛋白酶＞单宁酶；3种酶用量的最优组合比例为：支链淀粉酶0.006 5%、中性蛋白酶0.005 5%、单宁酶0.005 5%，对红茅烧酒沉淀问题的解决效果最好；方差分析表明：支链淀粉酶对红茅烧酒沉淀量具有极显著影响（P＜0.01），而中性蛋白酶和单宁酶对红茅烧酒的沉淀量不具有显著影响（P＞0.05），这可能是因为高粱中淀粉的含量远高于蛋白质和单宁，融入到酒中的淀粉含量也更高，对红茅烧酒的沉淀影响也最大。

2.5验证试验

以正交试验中结果最好的组合：支链淀粉酶0.006 5%、中性蛋白酶0.005 5%、单宁酶0.006 0%和正交试验分析得到的最优组合：支链淀粉酶0.006 5%、中性蛋白酶0.005 5%、单宁酶0.005 5%，分别记为组合1和组合2，以及3种酶的最适用量作为试验组、不加酶处理的作为对照组，以确定解决红茅烧酒沉淀问题的最优条件，验证试验结果见图5。

图5　验证试验结果Fig.5The results of validation experiment

试验结果表明：试验组与对照组之间均具有显著差异，表明酶制剂澄清法能够在一定程度上解决红茅烧酒的沉淀问题；3种酶组合使用与3种酶单独使用的结果之间具有显著差异，表明将3种酶组合使用更有利于解决红茅烧酒的沉淀问题；正交试验的最优组合和正交试验结果最好组合之间沉淀量不具有显著差异，即两种组合对红茅烧酒沉淀问题的解决效果不具有显著差异，综合经济原则考虑，最终确定酶制剂澄清法解决红茅烧酒沉淀问题的最优组合为：支链淀粉酶0.006 5%、中性蛋白酶0.005 5%、单宁酶0.005 5%，沉淀干重最低能达到3.29 mg/L。

3　结论

针对红茅烧酒浑浊、沉淀的问题，在前期研究的基础上采用酶制剂澄清法从酿造工艺入手，分别以支链淀粉酶、中性蛋白酶、单宁酶与蒸煮后的糯红高粱在适宜温度下拌合，用优质小曲基酒浸泡4个月后过滤，静置一年后观察沉淀量，通过单因素试验、正交试验及验证试验进行探究，结果表明：以支链淀粉酶0.006 5%、中性蛋白酶0.005 5%、单宁酶0.005 5%组合使用澄清效果最好，沉淀干重最低能达到3.29 mg/L，由此可知利用酶制剂来解决红茅烧酒沉淀问题具有很好的效果。

4　讨论与展望

红茅烧酒在货架期出现浑浊和沉淀是一个非常棘手的问题，至今尚未得到很好的解决。本试验在前期分析的基础上从酿造工艺入手，利用酶制剂澄清法来解决红茅烧酒的沉淀问题，取得了一定的研究成果，对解决红茅烧酒的沉淀问题以及指导实际生产具有一定的指导意义。同时酶将高粱中的大分子物质分解成小分子物质，更多的营养物质融入到了酒中，增加了酒中的营养成分，在一定程度上提高了酒质。当然也存在许多不足之处，如企业在生产原料，生产工艺流程，浸泡与勾兑，储存方法等关键环节缺少大量细致的研究和基础数据，生产中的很多环节都是生产工人凭经验来进行操作，缺少科学的数据来进行生产指导，而且生产中关键的操作和流程并未得到严格地监控，每批酒的产量和质量都参差不齐，影响因素众多。因此，要彻底解决红茅烧酒的沉淀问题，必须先建立一套科学完善的生产工艺，对每一步生产都严格把控，在此基础上对红茅烧酒沉淀问题进行研究才更准确，更科学，更具针对性。我们期待更多的专家和学者研究红茅烧酒，发现其他的影响因素和解决方法，更好地解决红茅烧酒的沉淀问题，为丰富白酒品类做出贡献。

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Research on Enzyme Preparation to Solve the Precipitation Problems of Hongmaoshao Liquor

XIE Jun1，2，LUO Hui-bo1，2，*，HUANG Zhi-guo1，2，WEI Chun-hui1，2，ZONG Xu-yan1，2，YE Hui-min1
（1.School of Biotechnology Engineering，Sichuan University of Science&Engineering，Zigong 643000，Sichuan，China；2.Liquor Making Bio-technology&Application of Key Laboratory of Sichuan Province，Zigong 643000，Sichuan，China）

The methods of enzyme preparation clarification were used to research on the turbidity and precipitation problems of Hongmaoshao liquor through single-factor experiment，orthogonal experiment and verification experiment.The results showed that，the composite enzymes with the proportion of 0.006 5%pullulanase，0.005 5%neutral protease and 0.005 5%tannase had the best clarifying effect，which was an effective material to solve the precipitation problems of Hongmaoshao liquor.

Hongmaoshao liquor；precipitation；enzyme preparation；clarification

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.20.028

大学生创新创业训练计划项目（201410622009）

谢军（1990—），男（汉），硕士，主要从事酿酒生物技术方面的研究。

罗惠波（1969—），男（汉），教授，硕士，主要从事酒类发酵方面的研究。

2015-11-30