杏仁黄酮的提取及抗氧化活性的研究

黄丽华，邵玲，李芸瑛

（肇庆学院生命科学学院，广东肇庆526061）

杏仁黄酮的提取及抗氧化活性的研究

黄丽华，邵玲，李芸瑛

（肇庆学院生命科学学院，广东肇庆526061）

以南杏、北杏和美国大杏仁为材料，通过超声波辅助提取法提取黄酮，比较这3种杏仁中黄酮的含量，结果：美国大杏仁总黄酮含量最高、南杏次之、北杏最低。通过3种杏仁的黄酮提取物对清除羟自由基（·OH），超氧阴离子自由基（O2-·）和DPPH·自由基的清除能力并与维生素C作比较，研究分析其抗氧化活性，结果表明3种杏仁都具有较强的清除自由基的能力，其中对DPPH·自由基的清除能力比维生素C还要强。

杏仁；黄酮；抗氧化活性

杏仁，属于蔷薇科落叶乔木杏、山杏、野杏成熟果实的核仁，是常用的中药之一，杏仁分为两种，药用多用苦杏仁（俗称北杏仁），它性微温，味苦，可降气平喘止咳，润肠通便，但略微有毒性，不可多服；食用的多为甜杏仁（俗称南杏仁）。而美国大杏仁在中医中不作药用，但是其营养价值较高，体内富含多种蛋白质、维生素及微量元素，特别是含有大量的维生素E和黄酮类化合物，有很强的抗氧化作用［1］。杏仁富含黄酮类和多酚类成分，是降低人体胆固醇的不错中药，黄酮类化合物有预防心脏病和减少心肌梗塞的作用，因此，常食杏脯、杏干，对心脏病患者有一定好处［2］。它能够增加脑血管流量，改善脑血管循环功能，保护脑细胞，扩张冠状动脉，防止心绞痛及心肌梗塞，防止血栓形成，提高机体免疫能力［3］。对冠心病、心绞痛、脑动脉硬化、老年性痴呆、高血压病人均十分有益。

目前国内对杏仁黄酮的研究报道相对还比较少，本试验通过对美国大杏仁、南杏和北杏3种杏仁中黄酮的提取及其清除自由基的能力的比较，旨在通过体外试验体系研究3种杏仁中黄酮类化合物的抗氧化活性，为杏仁中黄酮类化合物作为天然抗氧化剂和功能性食品的开发利用提供一定的参考。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

杏仁（美国大杏仁、南杏、北杏）：均采购于肇庆市二马路批发市场，粉碎，脱脂，烘干。

水杨酸（分析纯）、无水乙醇（分析纯）、盐酸奈乙二胺（分析纯）、DPPH（分析纯）、过氧化氢（分析纯）：均购自广州威佳公司。

1.2仪器

FA2004A电子天平：上海精密科学仪器有限公司；ZKJ-1型真空泵：上海嘉鹏科技有限公司；UA-2550型紫外可见分光光度计：日本岛津公司；KJ1012B超声波清洗器：广州市番禺科进超声波设备厂。

1.3方法

1.3.1杏仁黄酮提取工艺流程

杏仁粉末→加乙醇→超声波处理→抽滤→定容→黄酮提取液

分别准确称取南杏、北杏和美国大杏仁粉末各5 g于三角烧瓶中，按料液比1∶20（g/mL）分别加60%体积分数的乙醇溶液，震荡使其得到充分混匀，在75℃温度下超声波辅助提取2 h，再抽滤得到的提取液用60%体积分数的乙醇溶液定容至100 mL的容量瓶中作为待测液［4］。

1.3.2芦丁标准曲线的绘制

准确称取经110℃干燥至恒重的的芦丁样品20mg于50 mL的容量瓶中，用60%体积分数的乙醇溶液溶解，定容，充分摇匀，得到标准溶液。精密吸取该标准液0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL，分别置于25 mL的容量瓶中，加5%的亚硝酸钠溶液0.7 mL，摇匀，放置6 min，再加5%质量分数的硝酸铝溶液0.7 mL，摇匀，放置6 min，加1 mol/mL的氢氧化钠溶液5 mL，最后用60%定容至刻度，摇匀，静置5 min，以第一管为空白，在510 nm处测其吸光度［5］。制作标准曲线图，见图1。

图1　芦丁标准曲线Fig.1Rutin standard curve

1.3.3提取液中黄酮含量的测定

准确吸取0.5 mL的提取液，按方法2.2测定其吸光度，根据标准曲线计算3种提取物的总黄酮含量。

1.3.4对羟（·OH）自由基清除作用的测定

采用分光光度法及甲基Fe2++H2O2反应体系［6］：取3个5 mL容量瓶，分别依次加进0.05 mol/L pH 8.0 Tris-HCl缓冲液1.0mL，0.02g/L亚甲蓝0.5mL，2mmol/L FeSO4溶液0.50 mL，再分别加入样品提取液1.0 mL，0.5%过氧化氢溶液0.5 mL，蒸馏水稀释至刻度。37℃水浴加热反应60 min，在664 nm处测定其吸光度（A加样），在其他条件不变的情况下，分别再用蒸馏水来代替样品提取液测得的吸光度为空白吸光度（A损伤）。以不加H2O2和样品溶液测定（A未损伤），同时用等质量浓度的的VC代替样品做阳性对照。

1.3.5对超氧阴离子自由基（O2-·）的清除作用

采用在弱碱条件下邻苯三酚自氧化法测定样品清除超氧阴离子自由基的活性［7］：取4.5 mL的pH为8.2的0.05 mol/L的Tris-HCl溶液，置于25℃水浴中加热30 min，分别加入1.0 mL试样和3 mmol/L的邻苯三酚溶液0.4 mL，混匀，在25℃水浴中5 min，加入8 mol/L的盐酸0.5 mL终止反应，于318 nm处测定吸光度（A样）。空白对照（A0）以相同体积的蒸馏水代替样品。同时用等质量浓度的VC代替样品做阳性对照。

1.3.6对DPPH·自由基的清除作用

按照表1的要求添加反应液［8］。

表1　样品试剂添加方法Table 1Sample reagent adding methods

DPPH·自由基清除能力的公式：DPPH·清除率/%=［1-（Ai-Aj）］/A0×100

试验重复3次，求平均值。

2　结果与分析

2.13种杏仁中总黄酮的含量

用超声波辅助法提取3种杏仁中的黄酮含量，结果见表2。

表2　杏仁中黄酮含量Table 2Flavonoid in the amygdala

试验结果表明：3种杏仁中黄酮含量：美国大杏仁＞南杏＞北杏，其中美国大杏仁总黄酮含量达到1.58 g/100 g，大于另外两种杏仁。

2.2清除自由基活性比较

2.2.1对羟自由基的清除作用

羟自由基（·OH）是一种氧化能力很强的自由基，它能够很容易地氧化各种生物大分子，氧化效率高，反应速率快，是造成组织脂质过氧化、核酸断裂、蛋白质和多糖分解的一种活性氧自由基，与机体的衰老、肿瘤发生发展、辐射损伤和细胞吞噬有关［9］。

杏仁黄酮提取液对羟自由基清除结果见图2。

图2　杏仁黄酮提取液对·OH的清除作用Fig.2Almond extract flavonoids on·OH scavenging effect

由图2可知，杏仁有较强的清除作用，当3种杏仁在提取液质量浓度为1.0 mg/mL时，其对羟自由基的清除效果较明显，3者当中美国大杏仁对羟自由基的清除率最大，为58.21%，南杏为43.78%，北杏为41.89%，但在其它条件不变条件下，与相同质量浓度的维生素C相比，3者均小于维生素C的清除率，维生素C对羟自由基的清除率达到89.88%。

2.2.2对超氧阴离子自由基的清除作用

超氧阴离子自由基（O2-·）具有毒性作用，是人体内产生的活性氧自由基，可以引发体内脂质过氧化，加快肌体的衰老过程，并可诱发癌症、心血管疾病等，严重危害人体健康［7］。

3种杏仁和维生素C对超氧阴离子自由基的清除作用结果见图3。

图3　杏仁黄酮提取液对超氧阴离子自由基的清除作用Fig.3Almond extract flavonoids on the ultra oxygen anion free radical scavenging effect

由图3可知，当这3种杏仁在提取液质量浓度为1.0 mg/mL时，对超氧阴离子自由基清除作用明显，美国大杏仁的清除率最大为54.80%，南杏和北杏相对较小，分别为45.62%和42.00%，与维生素C相比，3者都小于维生素C，维生素C对超氧阴离子自由基的清除率为67.19%。

2.2.3对DPPH·自由基的清除作用

二苯代苦味肼基自由基（DPPH·）是一种稳定的有机自由基，通过检测抗氧化剂对DPPH·的清除能力可以表示其抗氧化性的强弱。其甲醇溶液在518 nm处有最大吸收，当与抗自由基的活性物质作用时，其吸收峰值会降低很多，吸收的峰值越低表明抗自由基活性物质的活性越强［8］。

DPPH·测定的机理可能是DPPH·使待测有机物形成不稳定的自由基中间体，进而双分子偶联形成稳定的最终产物［10］。3种杏仁和维生素C对DPPH·的清除作用结果见图4。

图4　杏仁黄酮提取液对DPPH·的清除作用Fig.4Almond extract flavonoids on DPPH·scavenging effect

由图4可知，提取液质量浓度为1.0 mg/mL时，美国大杏仁对DPPH·的清除率最大为95.46%，南杏92.71%，北杏92.08%，维生素C对DPPH·的清除率为90.13%，3种杏仁对DPPH·的清除率都大于维生素C。

3　结论

本试验利用超声辅助法［提取时间2 h，提取温度75℃，料液比1∶20（g/mL），乙醇体积分数60%］提取杏仁中的黄酮，确定了美国大杏仁，南杏和北杏这3种杏仁中总黄酮含量，结果显示，3种杏仁都含有较多的黄酮，总黄酮含量：美国大杏仁（1.58 g/100 g）＞南杏（1.14 g/100 g）＞北杏（1.07 g/100 g）。

试验测定杏仁提取物对羟自基（·OH）、超氧阴离子自由基（O2-·）和DPPH·3种自由基清除作用并与维生素C作对比。结果表明，在提取液浓度为1.0 mg/mL时，3种杏仁都具有较强的抗氧化活性，从DPPH的清除效果来看，对DPPH·自由基清除作用较强，均超过92%，美国大杏仁清除作用最强，达到95.46%，3种杏仁对DPPH的清除作用都超过了维生素C，美国大杏仁、南杏和北杏对羟自由基（·OH）及超氧阴离子自由基（O2-·）都有较强的清除作用，但均弱于VC。

可见杏仁中黄酮类化合物是一种很好的抗氧化剂，其体内黄酮含量较为丰富，可作为天然的抗衰老保健品，绿色食品抗氧化剂，在天然抗氧化剂和医药保健先关领域具有广阔的开发前景。

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Extraction and Antioxidant Activity of Flavonoids from Almond

HUANG Li-hua，SHAO Ling，LI Yun-ying
（College of Life Science，Zhaoqing University，Zhaoqing 526061，Guangdong，China）

The contents of flavonoids were extracted by ultrasonic assisted extraction method，and the contents of flavonoids in three kinds of almonds were compared.The scavenging ability of three kinds of extracts offlavonoids in the extract of hydroxyl radical（·OH），superoxide radical（O2-·）and DPPH free radical scavenging activity was compared with that of vitamin C.The results showed that three kinds of almond had strong ability to remove free radicals，and the scavenging ability of DPPH free radical was stronger than that of vitamin C.

almond；flavonoids；antioxidant activity

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.20.016

黄丽华（1972—），女（汉），高级实验师，学士，研究方向：植物生理生化及食品营养成分分析。

2015-12-14