熊果酸减肥作用的研究△

赵晨润夏焕春马　曦

（1.北京第一零一中学北京100091；2.中国农业大学动物科技学院北京100193）

熊果酸减肥作用的研究△

赵晨润1夏焕春1马曦2*

（1.北京第一零一中学北京100091；2.中国农业大学动物科技学院北京100193）

研究表明熊果酸（UA）对脂肪代谢有一定的影响，但研究多数采用UA食物添加或灌胃方式进行，而实际应用中饮用方式更为方便。因此，本论文研究饮用UA对脂肪产生的影响，结果表明饮用UA后雌性小鼠体重及脂肪量显著下降，雄性小鼠变化不显著；利用体外培养前脂肪细胞系加入UA，发现其分化受到抑制，脂滴显著减少。本论文首次发现饮用UA对雌性小鼠效果减肥优于雄性小鼠，为UA的生物功能开发及应用提供了有价值的实验参考。

熊果酸 小鼠 前脂肪细胞系 脂肪产生

熊果酸（ursolic acid，UA）又名乌索酸，是广泛存在于苦丁茶和山楂叶等天然植物中的一种化合物[1]。UA从天然植物中的提取工艺有很多的研究报道[2～5]，目前已有商品化的产品。研究表明熊果酸具有抗炎[6]、抗菌[7]、抗氧化[8]及抗癌[9]等多种生物学效应。此外，研究表明UA对脂质代谢有重要作用。2007年，林科等通过UA灌胃高脂模型小鼠，发现UA可以有效降低胆固醇及甘油三酯指数[10]。2010年，张杰等利用UA对胰岛素抵抗模型大鼠进行灌胃，发现UA能够减少腹腔脂肪堆积[11]。2014年，日本的Markwick NP等发现苹果皮中含有UA，并人工添加UA饲喂鳞翅类昆虫的幼虫，发现其体重显著减轻[12]。2009年，刘志芳等研究表明UA能够抑制胰脂肪酶的活性及构象[13]。2014年，单萍等研究发现熊果酸是一种胰脂肪酶抑制剂[14]。UA作为一种有潜在应用价值的植物活性成分，受到了科研工作者的关注。

目前大多以饲料添加或灌胃方式研究UA对脂肪的作用[10～12]，但在实际生活中UA以饮用方式来摄入更为方便。因此，本论文通过在饮用水中添加UA，探讨其对小鼠体重、腹部脂肪及脂肪细胞的影响。

1　材料

1.1试验动物：2月龄雌性及雄性Balb/c小鼠购于协和实验动物研究所。30只雌性或雄性小鼠各随机分为三组，每组10只：①正常饮水组，不添加UA；②饮用质量浓度为1μg·mL-1UA组；③饮用质量浓度为5μg·mL-1UA组。

1.2材料：高脂饲料购于北京科澳协力饲料有限公司，各组小鼠自由摄取高脂饲料。UA购于Sigma公司，纯度≧98.5％，用矿泉水配制为1μg·mL-1及5μg·mL-1供小鼠饮用，每隔2d更换饮水。

2　方法

2.1记录饮水量：每个水瓶均加100mL水，每隔2d换水时用量筒称量水瓶中剩余的水，减少水量即为每3d小鼠的饮水量，记录后进行统计分析。

2.2小鼠体重称量：每隔2d用天平称量小鼠的体重，记录体重变化，进行统计分析。

2.3小鼠脂肪的称量：饮用UA一个月后处死小鼠，用解剖键和镊子打开腹腔，取出腹部脂肪置于培养皿中用天平进行称量，记录脂肪的质量。

2.4前脂肪细胞系3T3-L1的培养：前脂肪细胞系3T3-L1为美国菌种保藏中心产品，此细胞的维持、扩增及分化培养需用3种培养基。①维持培养基：90％DMEM培养基，10％胎牛血清，1.0μg/mL胰岛素；②扩增培养需用前脂肪细胞扩增培养基：90％ DMEM培养基，10％小牛血清；③分化培养基：90％DMEM培养基，10％胎牛血清，1.0μM地塞米松；0.5mM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤；1.0μg/mL胰岛素。3T3-L1脂肪细胞是贴壁生长，实验在细胞培养室无菌条件下进行，细胞于37℃、5％CO2培养箱培养。

接种细胞到培养皿进行扩增，细胞长到细胞培养皿的70％前进行传代。细胞长到培养皿的70％～80％时弃掉上清，加入相同体积的分化培养基培养，48h后弃掉上清，利用脂肪细胞维持培养基进行培养，每隔48h更换脂肪细胞维持培养基；细胞诱导后7～10d完全分化。加入分化培养基48h后，分别加入1μg·mL-1或5μg·mL-1UA进行培养，d7后进行观察拍照。

2.5统计分析：采用一尾二型Student-t检验进行实验组与对照组数据的显著性差异分析。*表示P<0.05；**表示P<0.01。

3　结果与分析

3.1UA对小鼠饮水量及体重的影响：小鼠饮用UA后状态良好，与正常饮水组小鼠比无明显变化。雌性小鼠每3d饮用水量的结果如图1所示，饮用1μg·mL-1的UA组小鼠的饮水量比对照组（P<0.01）及饮用5μg·mL-1的UA组（P<0.01）显著增加。饮用5μg·mL-1的UA组小鼠的饮水量与对照组相比无显著变化。雄性小鼠每3d饮用水量的结果如图2所示，饮用1μg·mL-1的UA组及5μg·mL-1UA组小鼠与对照组相比均无显著变化。以上结果表明雌性及雄性小鼠饮用UA的量有显著不同，提示UA对雌性作用可能会更显著。

有研究报道UA饲食糖尿病模型小鼠能显著改善小鼠体重[15]。为了探讨UA对小鼠体重的影响，每隔2d称量小鼠体重进行统计分析。结果如图3所示，饮用1μg·mL-1UA雌性小鼠18d后体重与对照组相比明显下降（18d：P<0.05；21～30d：P< 0.01），饮用5μg·mL-1UA的雌性小鼠体重与对照组相比无明显变化；饮用UA对雄性小鼠体重无明显变化（图3），表明质量浓度为1μg·mL-1的UA只对雌性小鼠体重减轻有显著作用，对雄性小鼠无此作用。

3.2UA对小鼠脂肪产生的影响

有研究报道UA能够降低细胞内脂肪酸合成酶的表达量及活性，进而影响脂肪的合成[15]。饮用UA1个月后处死小鼠，取出腹部脂肪利用天平进行称量进行统计分析。结果如图5所示，饮用质量浓度为1μg·mL-1UA雌性小鼠脂肪重量与其他两组相比显著下降（P<0.01）；饮用5μg·mL-1UA的雌性小鼠腹部脂肪与对照组相比显著下降（P<0.01），表明饮用质量浓度为1μg· mL-1UA效果最好。雄性小鼠结果如图6所示，只有饮用质量浓度为1μg·mL-1UA的小鼠腹部脂肪比对照组显著减少（P< 0.05），与饮用5μg·mL-1UA组无差异。

3.3UA对前脂肪细胞系3T3-L1的影响：将未分化3T3-L1细胞加入24孔板进行培养，每组设3个重复空。未分化的前脂肪细胞系3T3-L1形态如图5所示。细胞长到培养皿的70％～80％时弃上清加入分化培养基培养，48h后弃掉上清，利用维持培养基进行培养，每隔48h更换脂肪细胞维持培养基；细胞诱导后7～10d完全分化，可看到有脂滴形成（图7）。

加入分化培养基48h后，加入1μg·mL-1或5μg·mL-1UA进行培养，d7后进行观察拍照。结果如图8所示，加入1μg·mL-1UA的脂肪细胞分化受到抑制，且形成大脂滴明显少于其他两组，而加入5μg·mL-1的UA的脂肪细胞组与对照组相比无显著差异。以上结果表明1μg·mL-1的UA能够抑制脂肪细胞分化，并减少脂肪细胞脂滴的形成。

4　讨论

UA广泛存在于多种天然植物中，研究表明具有抗炎、抗菌及降血糖等多种生物学效应[6～9]。此外，UA对动物体的脂肪代谢的影响已有报道。2003年，熊筱娟等发现UA能够显著降低急性肝损伤大鼠肝脏及血清中甘油三酯水平，促进肝糖原产生，并减轻肝细胞损伤[16]。2007年，林科等提取山楂中的UA制成纳米级的乳浊液，灌胃小鼠14d后诱导高脂模型进行UA预防实验；同时诱导高脂模型小鼠后UA灌胃进行治疗。结果表明治疗组和预防组均能一定程度降低高脂小鼠的胆固醇及甘油三酯的水平，且UA预防高脂小鼠的作用优于高脂小鼠的治疗作用[10]。2010年，张杰等发现UA能够减少胰岛素抵抗模型大鼠腹腔脂肪堆积，提示灌胃方式摄入UA对腹腔内脂肪重量的增加有一定的抑制作用[11]。本论文结果表明雌性小鼠饮用1μg·mL-1或5μg·mL-1UA后均能显著减少腹部脂肪堆积，且1μg·mL-1的UA饮用小鼠效果较好（图5）；但雄性小鼠只有饮用1μg·mL-1的UA显著减少腹部脂肪产生，而且5μg·mL-1的UA饮用小鼠腹部脂肪减少不明显（图6），此结果与张杰等[11]等利用雄性大鼠胰岛素抵抗模型的结果一致。2014年，Markwick NP等人工添加UA饲喂鳞翅类昆虫的幼虫发现其体重显著减轻[12]。本论文结果表明雌性小鼠饮用1μg·mL-1在18d后体重显著减少，而5μg·mL-1的UA不能减轻体重（图3）；同时无论是1μg·mL-1的UA还是5μg·mL-1UA对雄性小鼠体重无影响（图4），此结果与Markwick NP等[12]结果一致，但本论文研究表明UA对雌性小鼠作用强于雄性小鼠，存在性别差异，但具体原因还需进行更多的研究。

UA对细胞水平的脂肪代谢有一定作用。2012年，樊慧锦等UA处理后，HepG2细胞的脂肪酸合成酶表达量及活性降低，且UA能诱导HepG2细胞的凋亡[17]。3T3-L1细胞是一种具有定向分化为成熟脂肪细胞的细胞系，能充分显示脂肪细胞的特点，包括形态学改变、多种脂肪代谢酶的表达、广泛的脂质积聚等，是体外研究脂肪细胞的理想实验细胞模型。2012年，李迪等发现10、20μmol/L的UA处理后的3T3-L1脂肪细胞分化程度低于对照组和罗格列酮组[18]。本论文发现3T3-L1细胞体外添加不同浓度的UA，1μg·mL-1UA能显著抑制3T3-L1细胞分化及脂滴的产生（图8），而5μg·mL-1UA效果不明显，此结果与李迪等的发现一致[18]。

以往的研究大多将UA加入饲料中或进行灌胃[11，12，15]，本论文将UA加入饮用水中让小鼠自由摄取，饮用UA的小鼠表现正常，但饮用1μg·mL-1UA的雌性小鼠饮用量显著高于对照组及饮用5μg·mL-1UA的雌性小鼠（图1），但雄性小鼠饮用量无显著差别，表明雌性小鼠饮用1μg·mL-1的UA对雌性小鼠的体重及脂肪减少作用显著，提示UA对小鼠脂肪产生的作用有性别差异，但其原因尚不清楚。

[1]肖坤福，郑云法，刘成左，等.熊果酸的研究进展[J].时珍国医国药，2005，16（12）：1298-1300.

[2]任秀莲，周春山，魏琦峰，等.苦丁茶中熊果酸的分离纯化研究[J].中国药学杂志，2004，39（8）：571-574.

[3]任秀莲，钟世安，周春山，等.苦丁茶中熊果酸的提取工艺[J].中南大学学报（自然科学版），2004，35（1）：70-74.

[4]陈鸿英，马雪梅.泽兰中齐墩果酸和熊果酸的提取、分离[J].天津中医药，2003，20（5）：74-75.

[5]马稳，李丹.夏桑菊中熊果酸的提取方法及可靠性研究[J].信阳师范学院学报，2003，16（3）：318-319.

[6]卢静，张博超，姜玮，等.熊果酸抗氧化性能的研究[J].食品工业科技，2009，30（4）：126-127.

[7]河南大学.一种天然化合物熊果酸在抗菌方面的应用[P].中国专利：CN101543499，2009-09-30.

[8]Subbaramaiah K，Michaluart P，Sporn MB，et al.Ursolie acid inhibits cyclooxygemse-2 transcription in human mammmy epithelial cells[J].Cancer Research，2000，60（9）：2399-2404.

[9]刘琼，叶秀峰，张徽.熊果酸抑制胶质瘤裸鼠移植瘤生长及其机制的初步探讨[J].第三军医大学学报，2009，31（11）：1041-1044.

[10]林科，张太平，张鹤云.山楂中熊果酸的提取及其对小鼠的降血脂作用[J].天然产物研究与开发，2007，19：1052-1054.

[11]张杰，吴淑艳，王琳，等.熊果酸对高脂饮食诱导胰岛素抵抗大鼠脂质代谢的影响[J].中华中医药学刊，2010，28（5）：975-978.

[12]Christeller JT，McGhie TK，Poulton J，et al.Triterpene acids from apple peel inhibit lepidopteran larval midgut lipases and larval growth[J].Arch Insect Biochem Physiol，2014，86（3）：137-150.

[13]刘志芳，田萌，马跃文，等.熊果酸和齐墩果酸对胰脂肪酶活性及构象的影响[J].时珍国医国药，2009，20（10）：2600-2602.

[14]单萍，赵淑娥.紫外一荧光分光光度法联用测定熊果酸对胰脂肪酶的抑制作用[J].江西科学，2014，32（3）：309-313.

[15]Sun Mi Jang，Sung Tae Yee，Jina Choi，et al．Ursolic acid enhances the cellular immune system and pancreatic β-cell function in streptozotocin-induced diabetic mice fed a high-fat diet[J].International Immunopharmacology，2009，9：113-119.

[16]熊筱娟，陈蔚云，崔江龙，等.乌索酸对大鼠胆汁的影响[J].中医药学报，2003，31（4）：54.

[17]樊慧锦，田维熙，马晓丰.熊果酸抑制脂肪酸合酶及诱导HepG2细胞凋亡机制研究[J].北京师范大学学报（自然科学版），2012，48（3）：266-269.

[18]李迪，王冠粱，山梦雅，等.熊果酸对3T3-LI脂肪细胞胰岛素抵抗模型CAP表达的影响[J].中西医结合学报，2012，10（8）：886-893.

Effect of Ursolic Acid on Fat production

Zhao Chenrun1Xia Huanchun1Ma Xi2*（1.Beijing 101 high school，Beijing 100091，China；2.China Agricultural University College of animal science and technology，Beijing 100193，China）

Aim：Many studies have shown that ursolic Acid（UA）has many biological effects.Mostly studies focus on adding UAinto diet or gavage manner，but drinking UAis more convenient in real life.This study aimed at the effect of UAon losing fat.Method：The mice with high fat feedstuff was taken UAin drinking way，then the fat production was checked，and also the differentation and lipid droplets of preadipocytes cell line after UAtreatment.Results：The results showed body weights and abdominal fat from female mice drinking 1μg·mL-1UAwere significantly decreased compared with other groups.However，in female mice there was no difference of body weights.There were similar results in preadipocytes cell line treated with UA.The differentiation of preadipocytes cells was suppressed and the lipid droplets were reduced when cells were treated with 1μg·mL-1UA，but 5μg·mL-1UAtreatment had no effect on preadipocytes cells.Conclusion：In summary，right dosage of UAcould decrease fat production in female mice and cell line，but not in male mice.

Ursolic Acid Mice Preadipocytes cell line Fat production

R285

B

1672-8351（2016）10-0128-03

△国家自然科学基金（31272448）和中国科学技术协会青少年后备人才计划资助。