研究荧光原位杂交技术用于急性早幼粒细胞白血病患者诊治中的临床效果

廖丽娟

【摘要】 目的 研究在急性早幼粒细胞白血病（APL）患者诊治中应用荧光原位杂交技术（FISH）的临床效果。方法 20例疑似APL患者作为研究对象， 应用FISH检测PML-RARa融合基因， 分析检测结果。结果 20例患者中确诊为APL患者有15例， 其中 PML-RARa融合基因检测结果为阳性的有14例， 阴性的有1例， 这1例患者经检查诊断为APL变异型， 诱导治疗没有取得显著效果；疑似APL的5例患者 PML-RARa融合基因检测结果都为阴性， 经其他检查诊断为急性髓细胞白血病M2。PML-RARa融合基因检测敏感度为93.3%， 特异性为100.0%。结论 FISH能够准确检测 PML-RARa融合基因， 提高APL的诊断准确率， 值得推广。

【关键词】 荧光原位杂交技术；急性早幼粒细胞白血病；诊治

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2016.25.029

APL是一种特殊的急性白血病， 患者会有严重的出血倾向， 并且很容易伴发弥散性血管内凝血， 死亡率较高[1]。APL患者中绝大多数都存在特异的染色体易位t， 从而有PML-RARa融合基因形成[2]。PML-RARa融合基因是APL的一项重要指标， 可以作为诊断标准之一。FISH操作简便， 结果的准确性高[3]。本研究主要分析FISH对于APL的诊治效果， 报告如下。

1 资料与方法

1. 1 一般资料 选取本院2014年7月～2015年7月收治的20例疑似APL患者， 其中男13例， 女7例， 平均年龄（44.9±9.3）岁， 平均病程（1.42±0.97）年；有9例患者出血是主要临床症状， 其中2例为结膜出血、1例为皮肤紫癜、3例为鼻出血、3例为齿龈出血；有8例患者乏力、头晕为主要临床症状；有3例患者发热为主要临床症状。20例患者经临床诊断确诊为APL的患者有15例。

1. 2 方法

1. 2. 1 制备细胞 选取患者1 ml肝素抗凝骨髓， 利用Ficoll对单个核细胞进行分离， 利用0.56%氯化钾溶液对细胞进行低渗处理， 然后完成固定和滴片。

1. 2. 2 融合基因探针 PML探针为红色荧光信号， RARa探针为绿色信号。

1. 2. 3 杂交 在70%甲酰胺/2×SSC的温度为73℃变性液中将玻片浸泡5 min， 然后借助乙醇进行1 min的脱水处理， 气干待用。在73℃水浴中将探针混合物进行5 min的变性， 滴在45℃预温的带杂交玻片上， 然后完成盖片和封胶处理， 放入37℃的湿盒中进行16～20 h的杂交处理。按照顺序浸入73℃ 0.4×SSC、2×SSC/0.1% NP40中进行漂洗， 在避免阳光直射的条件下气干， 添加10 DAPI进行复染， 然后进行盖片封片。

1. 3 判定标准 在同一视野下借助显微镜利用两种滤光片对杂交信号进行观察， PML-RARa融合基因阴性细胞可以观察到2绿和2红分离的杂交信号， 阳性细胞可以观察到1红1绿和2红绿融合的4个信号。每例计数>200个中期分裂象， 计算阳性率。阴性对照：选择10例正常骨髓样本， 选择PML-RARa融合基因探针完成FISH检查， 有阳性信号出现百分率均数为0.8%， 标准差为1.03%， 异常阈值为均数与3倍标准差之和， 最后计算出为3.9%。所以， 阳性病例标准为阳性信号细胞百分率>3.9%。

2 结果

2. 1 15例被确诊为APL的患者14例PML-RARa融合基因结果为阳性， 在阳性样本中， 阳性细胞率在9.5%～80.2%之间（异常阈值=3.9%）， 检测敏感度为93.3%， 特异性为100.0%；PML-RARa融合基因结果为阴性的患者有1例， 对该患者进一步进行骨髓染色体检查以及流式细胞学检查最后诊断为变异型M3。疑似APL的5例患者利用FISH技术检测PML-RARa融合基因结果显示都是阴性， 另外进一步骨髓染色体检查以及流式细胞学检查也无法诊断为APL。

2. 2 14例PML-RARa融合基因结果为阳性的患者接受并完成诱导治疗的患者有12例， 其中2例在10 d内死亡， 其余患者在结束治疗后症状均有明显缓解。12例患者中进行维持和巩固治疗的患者有10例， 其余2例失访。10例接受巩固维持治疗的患者中有9例直到现在仍为缓解状态， 借助FISH技术检测PML-RARa融合基因结果都是阴性。在治疗期间出现病情加重的患者有1例， 借助FISH技术检测PML-RARa融合基因结果为阳性， 最后由于心力衰竭死亡。

2. 3 PML-RARa融合基因结果为阴性的1例APL患者进行了诱导治疗60 d后还是没有全部缓解， 借助FISH技术对PML-RARa融合基因进行检测结果都显示为阴性， 直到现在病情都没有得到改善。

2. 4 疑似APL的5例患者， 借助FISH技术对PML-RARa融合基因进行检测结果都是阴性， 之后经其他方式诊断为急性髓细胞白血病M2。给予常规化疗治疗后得到有效缓解。

3 讨论

近些年对于分子生物学以及细胞遗传学研究的不断深入， 以往对于FAB的分型基础为细胞化学和形态学， 当前逐渐形成了MICM分型， 联合了分子生物学、细胞遗传学、免疫学、细胞形态学[4]。以往FAB分型主要不足包括：①由于基础为细胞化学检查和细胞形态学， 导致其诊断准确性只有65%左右， 部分APL的细胞形态很容易混淆急性髓细胞白血病M2。②诊断APL一个重要的标准是早幼粒细胞>30%， 另外急性髓细胞白血病M2诊断的一个重要标准是早幼粒细胞>10%， 而计数早幼粒细胞有50%都是靠医生直接的肉眼观察[5， 6]。所以这两类分型的白细胞主观性比较强。

本研究对PML-RARa融合基因借助FISH技术进行检测， 结果敏感性为93.3%， 疑似APL的5例患者检测结果均为阴性， 通过其他各类检查排除APL， 这也很好的说明了PML-RARa融合基因借助FISH技术检测的敏感性较高， 用于APL诊断中的价值非常显著， 值得临床推广。

参考文献

[1] 张济， 李羿， 李君君， 等.应用RT-PCR和荧光原位杂交监测急性早幼粒细胞白血病微小残留白血病.中国实验诊断学， 2012， 16（3）：423-425.

[2] 刘洋， 雷婷， 陈双， 等.急性早幼粒细胞白血病染色体易位联合R显带和间期荧光原位杂交技术分析.新疆医科大学学报， 2013， 36（7）：938-941.

[3] 刘小宁， 于亮， 曹维克， 等.一例同时伴有t（7；17；15）和8p-的急性早幼粒细胞白血病的临床研究.苏州大学学报（医学版）， 2011， 31（3）：448-450.

[4] 黄正刚， 陈启文， 吴星恒， 等.荧光原位杂交技术检测 PML/RARa 融合基因在儿童 APL 微小残留病中的应用.实用临床医学， 2015， 16（11）：65-68.

[5] 王蓉， 缪扣荣， 仇海荣， 等.间期荧光原位杂交和常规染色体分析诊断急性早幼粒细胞白血病的比较.中国实验血液学杂志， 2011， 19（4）：983-986.

[6] 吴东升. 三氧化二砷联合全反式维甲酸治疗初治急性早幼粒细胞白血病临床观察. 中外医学研究， 2014， 12（12）：30-31.

[收稿日期：2016-04-22]