真菌抑菌剂在马铃薯开放式组织培养中的应用

康 俊

乌兰察布职业学院，内蒙古乌兰察布 012000)



真菌抑菌剂在马铃薯开放式组织培养中的应用

康 俊

乌兰察布职业学院，内蒙古乌兰察布 012000)

[目的]研究马铃薯开放式组织培养中的最佳抑菌剂及其浓度。[方法]利用平板生长抑制法对多锰锌、甲基托布津2种抑菌剂的抗性进行筛选，将筛选出的最佳抑菌剂作为马铃薯开放式组织培养抑菌剂，研究其污染控制效果及其对组培苗生长的影响。[结果]培养基中添加不同浓度的多锰锌及甲基托布津对真菌的抑制与对照相比均差异显著，多锰锌抑菌效果优于甲基托布津。[结论]培养基添加0.10 g/L多锰锌(多菌灵含量16%，代森锰锌含量34%，可湿性粉剂)抑菌效果好且苗的生长状况最佳，可作为马铃薯开放式组织培养中的抑菌剂。

抑菌剂；马铃薯；组培培养；开放式

随着马铃薯产业化技术快速发展，马铃薯脱毒快繁技术已经实现规模化生产。但传统的组织培养方法对环境要求严格，必须在无菌条件下操作，需要超净工作台和高压灭菌锅等仪器设备。且培养基在高压灭菌时需要耗费大量电能，是组织培养成本较高的主要因素。开放式组织培养是指通过优化试验技术降低污染率，使植物组织培养操作脱离严格无菌环境，在自然、开放的有菌条件下进行，培养基无须灭菌，最终达到与严格无菌环境组织培养同样的效果[1-2]。与传统组织培养方法相比，开放式组织培养技术特点在于其可以使培养容器的选择范围变大，无须耐高温高压的材料，同时培养基及接种器具无须高压灭菌，操作方便，大幅度降低组织培养成本等。但植物开放式组织培养技术的关键在于找到有效的抑菌剂。研究表明，随着抑菌剂浓度的增大其对植物生长发育的抑制作用增大。因此，有效抑菌剂的选择对开放式组织培养尤为重要。

若开放式组织培养技术在马铃薯组织培养中能成功应用，可有效降低马铃薯组织培养成本。目前，利用农药[2-4]、抗生素[4-6]、防腐剂[8]、复合型抑菌剂[9]、次氯酸钠[10-11]等作为开放式组织培养的抑菌剂均有报道。笔者通过比较抑菌剂多锰锌及甲基托布津在马铃薯开放式组织培养中的抑菌效果和对扩繁组培苗生长的影响，确定多锰锌在马铃薯开放式组织培养中的最佳抑菌剂及其使用浓度范围，以期为今后马铃薯开放式植物组织培养的进一步研究提供技术支持。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1杀菌剂。多锰锌(国光英纳，可湿性粉剂，四川国光农化股份有限公司)；甲基托布津(国光松尔，50%可湿性粉剂，四川国光农化股份有限公司)。1.1.2培养基。孟加拉红培养基(蛋白胨 5 g、葡萄糖 10 g、磷酸二氢钾 1 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、琼脂20 g、1/3 000孟加拉红溶液 100 mL、氯霉素 0.1 g、蒸馏水 1 000 mL)；MS培养基[7]。

1.1.3植物材料。供试材料为马铃薯普通栽培种“Atlantic”，由乌兰察布职业学院马铃薯研究所提供。

1.2抑菌剂的筛选

1.2.1污染菌种的分离纯化。从被真菌污染的马铃薯组培苗中分离到污染霉菌，进行划线分离纯化。挑取单菌落，接种至斜面孟加拉红培养基上，于28 ℃下恒温培养7 d左右，接种至平面培养基上培养，长满平皿后备用。

1.2.2污染真菌的鉴定。在孟加拉红培养基上28 ℃下培养3 d，比较菌株的群体形态特征，进行初步鉴定[12]，继续培养15 d后再鉴定。

1.2.3孟加拉红抗性培养基制备。分别配制0.01、0.05、0.10、0.15、0.20 g/L多锰锌及甲基托布津孟加拉红抗性培养基。将2种抑菌剂配制成1 000 mg/L的母液备用，按常规方法配制孟加拉红培养基，高压灭菌后趁培养基冷却凝固前在超净工作台上按试验设计浓度分别加入多锰锌及甲基托布津母液，振荡摇匀，并做好标记，每个浓度3次重复，空白对照不加药液。

1.2.4接菌。在无菌条件下，用高压灭菌的直径0.60 cm不锈钢打孔器在已培养好的菌落外缘切下带菌培养基柱——菌饼，将菌饼移至抗性培养基的中央(将有菌丝的一面紧贴培养基)，每个培养皿接一个菌饼，每个浓度3次重复，置于28 ℃温箱内，6、10 d后检查菌落生长情况。

1.3马铃薯开放式组织培养试验

1.3.1培养瓶及接种器具处理。 将培养瓶及盖子在0.1%的次氯酸钠水溶液中浸泡25 min，捞出滤干待用；接种器接种前用95%乙醇彻底灼烧灭菌，接种台用75%乙醇喷雾。

1.3.2MS抗性培养基的制备。将多锰锌可湿性粉剂分别加至MS培养基后搅拌均匀，配制成浓度梯度为0.01、0.05、0.10、0.15、0.20 g/L的MS培养基，以不加药剂不灭菌的MS培养基和不加药剂灭菌的MS培养基作为对照培养基，每瓶装20 mL(表1)。

1.3.3转接试管苗。将马铃薯苗分别扩繁至标记好的培养基中，每瓶10个茎段，每个浓度接10瓶，每个处理重复3次。放入组培室培养，培养条件：温度(25士2)℃，空气相对湿度70%，光照强度2 500 lx，光照时间14 h/d。20 d后统计污染率和植株成活率。

1.4数据处理试验数据用SAS 13.0进行分析。根据菌落直径计算相对抑菌率，计算公式：

生长直径=菌落平均直径-菌饼直径

相对抑菌率=(对照生长直径-处理生长直径)/对照生长直径×100%

表1不同浓度多锰锌加入MS培养基试验处理

Table 1Treatments composed of different concentrations of MnZn added to MS medium

处理Treatment培养基Compositionofamedium高压灭菌AutoclavedsterilizationCK1MS+30g/L蔗糖+35g/L琼脂否AMS+0.01g/L多锰锌+30g/L蔗糖+35g/L琼脂否BMS+0.05g/L多锰锌+35g/L琼脂否CMS+0.10g/L多锰锌+35g/L琼脂否DMS+0.15g/L多锰锌+35g/L琼脂否EMS+0.20g/L多锰锌+35g/L琼脂否CK2MS+30g/L蔗糖+48g/L琼脂是

2　结果与分析

2.1抑菌剂的种类及浓度筛选

2.1.1镜检鉴定结果。对分离纯化的2种菌株镜检，初步鉴定为青霉菌(Penicillium)和曲霉菌(Aspergillus)。青霉菌主要形态特征：有隔菌丝，有分身孢子梗，分生孢子成串，帚状(图1)；曲霉菌主要形态特征：有隔菌丝，有“孢子穗”，孢子成黄绿色(图2)。

图1　青霉菌菌落形态Fig.1　Colonies and spore spikes of penicillium

图2　曲霉菌菌落形态及孢子穗Fig.2　Colonies and spore spikes of aspergillus

2.1.2抑菌剂的抑菌效果。由表2和3可知，培养基中添加不同浓度的多锰锌及甲基托布津对青霉及曲霉均有抑制作用，与对照差异显著。 10 d后0.05 g/L以上浓度的多锰锌抑菌效果与甲基托布津差异极显著，且浓度与抑菌效果呈正相关。0.10 g/L以上浓度的多锰锌在6 d时对曲霉的抑菌率可达100%，明显高于甲基托布津。2种抑菌剂相比，多锰锌的抑菌效果明显优于各浓度甲基托布津，可作为有效的马铃薯开放式组织培养抑菌剂。

2.2多锰锌在马铃薯开放式组织培养中的污染控制效果及其对组培苗生长的影响由表4可知，0.10 g/L以上浓度的多锰锌对组培苗的污染均有较好的抑制作用。但高浓度的多锰锌，不仅对组培苗污染有抑制作用，还会影响苗的高度及根的形成。0.20 g/L多锰锌处理后，苗的生根数明显减少，且苗高较对照CK2减少46.03%。根系是主要的营养吸收和合成器官，与地上部分生长密切相关，因此，高浓度多锰锌处理后生根数的减少势必造成植株生长受阻。由此可知，既有抑菌效果又对组培苗生长影响较小的最佳多锰锌浓度为0.10 g/L。

表2　抑菌剂对青霉生长的影响

注：同列多锰锌各组与0.20 g/L甲基托布津组相比，a表示差异极显著(P<0.01)，b表示差异显著(P<0.05)，未标表示差异不显著。

Note: When various concentrations of MnZn in the same column were compared with 0.20 g/L thiophanate-methyl, a and b stand for extremely significant (P<0.01) and significant differences (P<0.05) respectively. Data without a or b stand for no significant difference.

表3　抑菌剂对曲霉生长的影响

注：同列多锰锌各组与0.20 g/L甲基托布津组相比，a表示差异极显著(P<0.01)，b表示差异显著(P<0.05)，未标表示差异不显著。

Note: When various concentrations of MnZn in the same column were compared with 0.20 g/L thiophanate-methyl, a and b stand for extremely significant (P<0.01) and significant differences (P<0.05) respectively.Data without a or b stand for no significant difference.

表4　多锰锌的抑菌效果及其对马铃薯组培苗生长的影响

3　结论与讨论

该试验以马铃薯脱毒组培苗为材料，通过在培养基中添加不同浓度的多锰锌及甲基托布津抑菌剂，确定了多锰锌可作为有效的开放式组织培养抑菌剂。在无超净工作台的情况下，0.10 g/L多锰锌的抑菌率可达100%。虽然开放式组织培养法培养苗的生长高度及生根数与高压灭菌法相比稍有差异，但在规模化生产中，开放式组织培养法可以节约设备，减少高压灭菌的电力消耗，节省培养基制作过程中的琼脂等凝固剂，还可以节约高压灭菌及试验开展前接种室紫外灭菌的时间，能较大程度地降低组织培养成本并提高效率。

目前尚无多锰锌作为开放式组织培养抑菌剂的报道。王晓煌等[2]研究表明，多菌灵600 倍液在烟草开放式组培中控制细菌、真菌的污染率均在10%以下。陈亚兰[13]研究表明，50%多菌灵可湿性粉剂对马铃薯组培苗生产中最常见的青霉菌、细菌和酵母菌3种菌具有较好的抑制作用，且对马铃薯试管苗的生长以及生根产生的负面影响最小。邵清松等[14]研究发现，1 g/L 多菌灵在金线莲组织培养中抑菌促生长效果优于甲霜灵和甲基托布津及其混合物。该试验结果表明，对真菌的抑制多锰锌优于甲基托布津，与邵青松等[14]

的试验结果一致。张健雄等[3]研究表明，当代森锰锌浓度0.2～0.3 g/L 时，其在东北红豆杉开放式组织培养中的抑菌效果较好，且对植物生长的影响较小，可作为最佳的抑菌剂浓度范围。该试验结果表明，0.1 g/L多锰锌对组培苗生长的影响较小，这是由于多锰锌为2种药剂的混合及马铃薯组培苗的耐药程度较高。同时该试验在转接前用0.1%的次氯酸钠浸泡培养瓶也能达到预期的抑菌效果，彭广霖等[15]研究发现，5～10 mg/L 次氯酸钠对马铃薯和切花菊组培苗的抑菌效果较好，苗木存活率达80%。解辉等[10]在巴西香蕉组培时发现，0.01%以上的次氯酸钠可有效抑制培养基的污染，外植体成活率高达81%。该试验未进行细菌抑菌剂的筛选，抗生素抑菌效果在很多研究中已经证实[5-7]。

该试验通过对多锰锌的抑菌效果及其对马铃薯组培苗的影响进行研究，结果表明，多锰锌可作为马铃薯开放式组织培养的抑菌剂，关于其对组培苗生长速度、后期转接扩繁效果及根的影响，以及与抗生素混合效果有待于进一步研究。

[1] 崔刚,单文修,秦旭，等.植物开放式组织培养研究初探[J].山东农业大学学报(自然科学版),2004,35(4):529-533.

[2] 王晓煌,黄胜琴,李玲. 4种抑菌剂在烟草开放式组织培养中的应用[J]. 广东农业科学,2015(5):58-62.

[3] 张健雄,李俊翔,户新宇，等.代森锰锌在东北红豆杉开放式组培中的应用研究[M]//张启翔.中国观赏园艺研究进展.北京：中国林业出版社，2012:233-235.

[4] 张薪薪,唐金花,王关林.抑菌剂在开放组培中的使用及效果研究[J].辽宁师范大学学报(自然科学版),2005,28(4):466-469.

[5] 李文兰,李华英,盛小伟.不同抗生素对罗汉果遗传转化受体系统的影响[J].分子植物育种,2010(3):529-532.

[6] 孙占育,曹彬,李红芳，等.长柄扁桃开放式组培试验研究[J].现代农业科技,2013(20):66-67.

[7] 王玉英.MS培养基的配制方法[J].植物杂志,1983(5):15.

[8] 王丹,刘霞.山梨酸钾在红豆杉开发式组织培养中的应用[J].安徽农业科学,2010,38(2):634-635.

[9] 卢加举,张正学,彭仕荣,等.复合型抑菌剂在甘蔗开放式组培中的应用研究[J].热带农业科学,2012(10):68-71.

[10] 解辉,莫廷辉,曾丽星．次氯酸钠在香蕉开放式组织培养中的应用研究[J].热带作物学报,2011,32(5):886-890.

[11] 吴桂容,曲芬霞,余炳锋.贺州荸荠开放式组织培养体系建立[J].北方园艺,2013(6):110-112．

[12] 魏景超．真菌鉴定手册[M].上海:上海科学技术出版社,1979.

[13] 陈亚兰.不同抑菌剂对马铃薯试管苗生长的影响[J].中国马铃薯，2012,26(5):260-263.

[14] 邵清松,刘洪波,赵晓芳,等.金线莲茎腐病菌的生物学特性及5 种杀菌剂对其抑制作用[J].中国中药杂志,2014,39(8):1386-1390.

[15] 彭广霖,李青,衣淑玉,等.次氯酸钠防治组培苗污染的研究[J].安徽农业科学,2012,40(16):8806-8808.

Application of Fungal Bacteriostat in Open Tissue Culture of Potato

KANG Jun-

Ulanqab Vocational College, Ulanqab, Inner Mongolia 012000)

[Objective] To determine the best fungal bacteriostat and its concentration in open tissue culture of potato. [Method] The resistance of two bacteriostats MnZn and thiophanate-methyl was sifted by using the method of flat growth restraint. In addition, the effects of the best bacteriostat as the bacteriostat in open tissue culture of potato on fungi and seedling growth were studied. [Result] Compared with the control, the inhibitory effects of different concentrations of MnZn and thiophanate-methyl on fungi were significantly better. The inhibitory effect of MnZn was better than that of thiophanate-methyl. [Conclusion] When the concentration of MnZn wettable powder was 0.10 g/L (the content of carbendazim was 16%, and the content of mancozeb was 34%), the antibacterial effect of MnZn and the growing status of seedlings were the best, so it can be used as a fungal bacteriostat in open tissue culture of potato.

Bacteriostat; Potato; Tissue culture; Open

内蒙古自治区高等学校科学研究项目(NJZC14383)。

康俊(1982- )，女，内蒙古乌兰察布人，讲师，硕士，从事植物病理和种薯繁育研究。

2016-08-03

S 188

A

0517-6611(2016)26-0108-03