高效液相色谱法测定痛风颗粒中落新妇苷的含量

代能捷，杨全伟，程　璐，黄文涛

(武汉市第一医院药学部，湖北 武汉　430022)



高效液相色谱法测定痛风颗粒中落新妇苷的含量

代能捷*，杨全伟，程璐，黄文涛#

(武汉市第一医院药学部，湖北 武汉430022)

目的：建立测定痛风颗粒中的落新妇苷含量的方法。方法：采用Waters e2685 C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5μm)，流动相为甲醇-0.1%磷酸(V∶V=40 ∶60)，检测波长为290 nm，流速为1.0 ml/min，柱温为30 ℃，进样量为10 μl。结果：落新妇苷进样量在0.099 8～0.998 0 μg(r=0.999 9)范围内与峰面积线性关系良好；精密度试验、重复性试验、稳定性试验的RSD均≤3.00%；平均加样回收率为101.54%，RSD=0.54%(n=6)。结论：本研究测定方法准确、稳定、简便，可用于痛风颗粒的质量控制。

痛风颗粒； 落新妇苷； 高效液相色谱法

痛风颗粒为武汉市第一医院应用多年的具有良好降尿酸作用的临床经验方。痛风颗粒由土茯苓、白英、薏苡仁、徐长卿等11味中药制成，具有淡渗利湿、健脾祛浊、通脉补肾的功能，主治由高尿酸血症引起的痛风。土茯苓为方中君药，查阅文献可知土茯苓中主要有效成分为落新妇苷，是二氢黄酮类化合物[1-3]。本研究建立了高效液相色谱法测定痛风颗粒中落新妇苷的方法，以期为该制剂的质量控制提供有效依据。

1　材料

1.1仪器与设备

Waters e2695型高效液相色谱仪，Waters 2489型紫外检测器(美国沃特斯公司)；百万分之一天平[赛多利斯(上海)贸易有限公司]。

1.2药品与试剂

落新妇苷对照品(中国食品药品检定院，批号：111798-201504)；痛风颗粒(武汉市第一医院制剂中心，批号：20150614)；甲醇、磷酸为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为蒸馏水。

2　方法与结果

2.1色谱条件

Waters e2685 C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5μm)；流动相为甲醇-0.1%磷酸(V∶V=40 ∶60)；检测波长为290 nm；流速为1.0 ml/min；柱温为30 ℃；进样量为10 μl。

2.2溶液的配制

2.2.1对照品溶液：精密称定4.990 0 mg落新妇苷对照品，加入50%甲醇溶液溶解并稀释至50 ml，摇匀，即得对照品溶液，溶液浓度为0.099 80 mg/ml。

2.2.2供试品溶液：精密称定样品0.50 g，加入50%甲醇溶液50 ml，称质量，超声溶解30 min，放冷，称质量，补液，滤过，取续滤液作为供试品溶液。

2.2.3阴性对照溶液：取不含土茯苓的样品，按照“2.2.2”项下方法制备阴性对照溶液。

2.3检测波长的选择

取“2.2.1”项下对照品溶液，采用紫外分光光度法进行全波长扫描，测定结果显示，最大吸收波长为290 nm。因此，本研究以290 nm作为检测波长[4-5]。

2.4专属性试验

取“2.2”项下对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液，按照“2.1”项下色谱条件进样测定。结果，供试品溶液液相色谱图中落新妇苷的色谱峰能够较好的分离，且阴性对照溶液液相色谱图在相同保留时间无色谱峰出现，表明本研究方法专属性良好，见图1。

A. 对照品溶液；B.供试品溶液；C.阴性对照品溶液A. Control solution; B. Test solution; C. Negative control solution图1　高效液相色谱图Fig 1　HPLC chromatogram

2.5线性关系考察

精密称取“2.2.1”项下对照品溶液1、2、4、6、8、10 ml，置于10 ml容量瓶中，用50%甲醇溶液定容至刻度，摇匀，分别制备成质量浓度为0.009 98、0.019 96、0.039 92、0.059 88、0.079 84、0.099 80 mg/ml的溶液，分别精密10 μl，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。以落新妇苷的质量浓度为横坐标(X)、峰面积为纵坐标(Y)，进行线性回归，得到回归方程：Y=2 336 982X-114 709，相关系数r=0.999 9。结果表明，落新妇苷在0.099 8～0.998 0 μg范围内线性关系良好。

2.6精密度试验

精密吸取“2.2.1”项下对照品溶液适量，按“2.1”项下色谱条件连续进样6次，记录峰面积。结果表明，落新妇苷峰面积的RSD=0.53%(n=6)，表明仪器精密度良好。

2.7重复性试验

称取样品适量(批号：20150614)，共6份，按照“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。外标法计算落新妇苷的平均含量为0.039 20 mg/ml，RSD为1.21%，表明本方法重复性良好。

2.8稳定性试验

精密吸取“2.2.2”项下供试品溶液，于室温(25 ℃)下放置0、1、2、4、8、12 h时，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果，落新妇苷峰面积的RSD为0.69%，表明供试品溶液在12 h内稳定性良好。

2.9加样回收率试验

精密称取已知含量的样品(批号：20150614)，每份0.25 g，共6份，置于具塞锥形瓶中，依次精密加入落新妇苷对照品(落新妇苷质量浓度：0.040 90 mg/ml)10 ml，对其加样回收率进行测定，见表1。计算分析可得，平均加样回收率为101.54%，RSD=0.54%，结果显示本次试验方法加样回收率良好。

表1　加样回收率结果Tab 1　Results of recovery tests

2.10样品含量测定

取3批痛风颗粒(批号：20150615、20150616、20150617)，按照“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件测定落新妇苷的含量，见表2。

表2　样品含量测定结果(mg/g)Tab 2　Content determination of samples(mg/g)

3　讨论

药效学研究结果证明，黄酮是药品治疗高尿酸血症的主要有效部位[6-9]。其中，落新妇苷能够抑制过氧化物酶的活性，清除次氯酸，增强机体抗氧化能力，从而起到降尿酸作用[10]。

有文献表明，高效液相色谱法测定土茯苓中落新妇苷的含量，流速、柱温等色谱条件对保留时间、分离度、影响不大[11-14]。也有文献报道，在复方土茯苓颗粒的提取工艺筛选中，采用落新妇苷作为考察指标，方法稳定可行[15]。

本研究表明，落新妇苷在290 nm处有最大吸收波长，故设定其为检测波长。在流动相选择上，考察了不同比例的甲醇-水、甲醇-0.1%磷酸分别作为流动相，结果表明，甲醇-水作为流动相时，落新妇苷拖尾现象较为明显。因此，本研究以甲醇-0.1%磷酸(V∶V=40 ∶60)作为流动相，其基线平稳，落新妇苷与杂峰具有较好的分离度，且无明显拖尾现象。

综上所述，本研究结果准确、方便稳定，可用于痛风颗粒中落新妇苷的检测，弥补了痛风颗粒质量控制标准中含量测定的空白，从而在生产环节保证痛风颗粒的有效性和稳定性，保障患者用药的安全与有效。

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Content Determination of Astilbin in Tongfeng Granules by HPLC

DAI Nengjie，YANG Quanwei，CHENG Lu，HUANG Wentao

(Dept.of Pharmacy, Wuhan the First Hospital, Hubei Wuhan 430022, China)

OBJECTIVE：To establish the method for content determination of astilbin in Tongfeng granules. METHODS: Waters e2685 C18(4.6 mm×250 mm，5 μm) column was adopted with the mobile phase of 0.1% phosphoric acid(V∶V=40 ∶60), detection wavelength of 290 nm and flow rate of 1.0 ml/min. And the column temperature was 30 ℃ with sample quantity for 10 μl. RESULTS: The linear range of the astilbin in concentration was 0.099 8-0.998 0 μg(r=0.999 9). Relative standard deviation (RSD) of accuracy test, repeatability test and stability test were≤3.00%. The average recovery rate was 101.54%，RSD=0.54%(n=6). CONCLUSIONS: The method is simple, accurate, and reproducible, which can be used for the quality control of gout granule.

Tongfeng granules; Astilbin; HPLC method

主管药师。研究方向：药物新制剂、新剂型研究。E-mail：25513218@qq.com

R927.2

A

1672-2124(2016)09-1232-03

10.14009/j.issn.1672-2124.2016.09.031

2016-06-10)

*药师。研究方向：中药制剂研究。E-mail：112803190@qq.com