基于氧化石墨烯荧光适体传感器的胰岛素检测

姜利英肖小楠 周鹏磊 张 培 闫艳霞 姜素霞 陈青华（郑州轻工业学院电气信息工程学院，郑州 450002）

基于氧化石墨烯荧光适体传感器的胰岛素检测

姜利英*肖小楠 周鹏磊 张 培 闫艳霞 姜素霞 陈青华
（郑州轻工业学院电气信息工程学院，郑州 450002）

采用荧光基团（FAM）标记的核酸适体作为识别元件，氧化石墨烯为淬灭剂，建立了一种高选择性、高灵敏度的核酸适体传感器。核酸适体与氧化石墨烯结合后，荧光淬灭，此时溶液无荧光；加入胰岛素后，溶液中荧光得到恢复。利用荧光分析法检测加入胰岛素前后，溶液中荧光强度的变化，获取了荧光适体传感器的线性度和灵敏度，实现对胰岛素浓度的测定。结果表明，在5×10-8～1×10-5mol/L范围内，胰岛素的浓度与溶液中荧光强度有良好的线性关系，检出限为10 nmol/L。采用此方法检测胰岛素，操作简便，检测速度快，准确性高，选择性好，检出限低。

荧光基团；核酸适体；氧化石墨烯；荧光适体传感器；胰岛素

1 引言

胰岛素（Insulin，INS）是胰脏中胰岛B（β）细胞分泌的一种蛋白质激素，既能促进血液中的葡萄糖进入肝、肌肉和脂肪等组织细胞，在细胞内合成糖元或转变成其它营养物质贮存起来；又能促进葡萄糖氧化分解释放能量，供机体利用，是维持血糖在正常水平的主要激素。胰岛素分泌不足或缺乏时，会引起高血糖，甚至是糖尿病。因此，能否准确测定血液中胰岛素的浓度，对高血糖及糖尿病的早期诊断、临床和基础研究具有重要的价值［1，2］。胰岛素的检测方法包括免疫分析法［3］、色谱法［4］，这两种方法操作繁琐，灵敏度低，难以应用到现场即时检测。现在研究较多的检测方法是电化学分析法［5～13］和荧光分析法［14～16］。

由于核酸适体具有高亲和力和高特异性，已成为制备生物传感器理想的识别元件［17～20］。Seyed等［2］利用了核酸适体和三股螺旋分子开关的独特性质，对胰岛素进行检测，检出限为9.97 nmol/L。Verdian等［15］基于胰岛素适体折叠荧光淬灭，实现了对INS的检测，检测范围为2～70 nmol/L。Ying等［16］以氧化石墨烯（Graphene oxide，GO）为淬灭剂，基于核酸适体荧光检测法得到INS的检出限为500 nmol/L，检测范围0.5～50μmol/L。氧化石墨烯可与DNA碱基发生强烈的π-π相互作用，稳定吸附单链DNA，使荧光淬灭，它的淬灭效率远高于常见的有机淬灭剂，且它的生产成本较低、制备简单，是研究生物传感器的热点材料［21～24］。

本研究采用荧光基团标记的单链DNA作为探针，以氧化石墨烯为淬灭剂，构建了对INS有特异性的荧光适体传感器，在检测范围与检出限方面获取了更好的结果。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

GL-16Ⅱ型离心机（上海安亭科学仪器厂）；DHG-9030A型电热恒温鼓风干燥箱（上海精宏实验设备有限公司）；07HWS-2数显恒温磁力搅拌器（杭州仪表电机有限公司）；电子天平（梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司）；F-7000荧光光谱仪（日本 HITACHI公司）获得。Tris-HCl缓冲液为（pH 7.4，50 mmol/L Tris-HCl，30 mmol/L NaCl，50 mmol/L KCl）。牛胰岛素（北京索莱宝科技有限公司）；2 mg/mL氧化石墨烯溶液（苏州恒球科技有限公司）。实验所用的寡核苷酸序列均由上海生工生物技术有限公司（中国）合成，其核苷酸序列如下：5′-GGT GGT GGG GGG GGT TGG TAG GGT GTC TTCFAM-3′。实验用水均为超纯水，实验温度为25℃。

2.2 工作溶液的制备

将100 μL 100μmol/L核酸适体加入到100 mL Tris-HCl缓冲液中，再加入5 mL GO，室温下静置10 min后，加入20 μL 100μmol/L PBA封闭未反应位点，即得到工作溶液。取25 mg INS加入25 mL工作溶液中，得到INS的浓度为174.4μmol/L，加入工作溶液稀释，分别得到0，0.05，0.1，0.2，0.5，1.0，5.0，10.0，50和100μmol/L的待测液各5 mL。装入离心管内，离心0.5 h，再静置1 h，使其充分结合。

2.3 样品的分析

在激发波长为480 nm，发射波长为521 nm的条件下，以不含INS的溶液作为空白对照组，用荧光光谱仪测定不同浓度的INS待测液的荧光强度。以荧光强度对相应浓度绘制标准曲线。

2.4 特异性检测

在标准曲线范围内选定浓度为5μmol/L，与检测INS相同的条件下，分别测定BSA、生物素和链霉亲和素的荧光强度，与相同浓度的INS的荧光强度作比较，并绘制柱状图。

3 结果与讨论

3.1 检测原理、胰岛素的激发和发射波长

利用核酸适体与氧化石墨烯组成的检测INS荧光适体传感器，检测INS的基本原理如图1所示。当没有目标分子（INS）加入时，核酸适体表面的荧光基团被GO吸附，溶液中有极其微弱的荧光强度；加入INS后，适体不断从GO表面游离，溶液中的荧光强度得以恢复。随着INS浓度的增大，溶液中的荧光强度也不断增大。根据荧光强度的变化可以实现对INS的检测。

图1 检测胰岛素的原理示意图Fig.1 Mechanism of insulin detection

分别取3 mL工作溶液和待测液，在荧光光谱仪上先固定一个合适的激发波长，优化发射波长（500～600 nm）；确定发射波长，优化激发波长。最终确定胰岛素的激发波长为480 nm，发射波长为521 nm，激发和发射的狭缝宽度设置为10 nm。

3.2 核酸适体与GO的量比对荧光强度的影响

若核酸适体的量过大，GO不能将适体完全吸附，溶液中还存在大量荧光，当加入INS后，荧光强度的变化不够明显，对实验结果有较大影响。若GO量过大，核酸适体的荧光被GO完全吸附后，溶液中无荧光，但存在一部分未与核酸适体结合的GO，加入INS时，从GO表面游离的核酸适体有可能再次被GO吸附，影响实验结果的准确性。核酸适体与GO不同的量比测得溶液中的荧光强度如图2所示。由图2可得，最终选择适体与GO的比例为1 nmol∶1 mg（曲线c），此时GO将完全吸附适体，荧光即将会完全淬灭。

3.3 缓冲液浓度对荧光强度的影响

缓冲溶液的浓度可以影响核酸适体的荧光强度，从而影响最终测得INS的荧光强度。本实验考察了不同浓度的缓冲液（50 nmol/L，50μmol/L，50 mmol/L）对最终实验结果荧光强度的影响，发现缓冲液浓度为50 mmol/L时，测得荧光强度最强，实验效果最好。最终确定缓冲液为Tris-HCl 50 mmol/L，NaCl 30 mmol/L，KCl 50 mmol/L。

图2 不同DNA与GO的比率相对应的荧光强度Fig.2 Fluorescence intensity corresponding to different ratios of DNA and GO

3.4 工作溶液与胰岛素结合时间对荧光强度的影响

工作溶液与INS结合的时间太短（0～30 min），测得荧光强度较弱，延长结合时间（30～60 min），荧光强度不断增强。当结合时间大于60 min，荧光强度趋于稳定。最终确定INS与工作溶液的最佳结合时间为60 min。需要注意的是，INS与工作溶液的结合时间不宜过长，否则会破坏核酸适体的结构，影响实验结果的准确性。

3.5 胰岛素的标准曲线及特异性实验结果

在上述实验条件下，INS浓度与相应的荧光强度的关系如图3所示，随着INS浓度增大，荧光强度不断增强。目标INS的浓度在5×10-8～1×10-5mol/L范围内，适体的荧光强度（y）和INS的浓度（x）有良好的线性关系（图4），线性回归方程为y=84.83571+16.0724x，相关系数R=0.99913，检出限为10 nmol/L。

在图3的标准曲线上选择一个浓度（5μmol/L），与检测INS的条件相同，得到的结果如图5所示。INS的荧光强度与牛血清蛋白（Bovine serum albumin，BSA），生物素（Biotin）和链霉亲和素（Streptavidin-biotin）明显不同，BSA、生物素、链霉亲和素与胰岛素的荧光强度比为1.0∶1.33∶1.07∶8.9。因此，本方法对胰岛素具有良好的选择特异性。

图3 胰岛素的荧光信号曲线Fig.3 Fluorescent signal curve of insulin

图4 胰岛素的浓度与荧光强度的关系曲线Fig.4 Calibration curve of insulin concentration and fluorescence intensity

3.6 实际样品的分析

INS加入到正常人的血清中，再加工作液，配制成不同浓度的待测液，采用本方法测其荧光强度（表1）。结果表明，本方法的测定结果与实际样品误差很小，每个浓度的样品平行测定5次，相对标准偏差小于5%，说明本方法具有良好的准确度和精密度。

表1 实际样品中胰岛素的测定结果Table 1 Determination results of insulin in real samples

图5 胰岛素对照组的荧光信号强度（5μmol/L）Fig.5 Fluorescent signal intensity of insulin in control group

4 结论

将能够与INS特异性结合的单链DNA与GO结合，构建了对INS有特异性的荧光适体传感器。根据缓冲液中INS加入前后荧光强度的变化，测定INS浓度，建立了一种快速检测INS的方法。本方法具有选择性好、方法简单、检测速度快、检出限低等优点。在此实验基础上，通过对实验条件的优化或更换淬灭效果更好的淬灭剂，能获取更好的实验结果。若条件允许，预测此方法在检测其它蛋白质分子方面具有良好的应用前景。

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This work was supported by the National Natural Science Foundation of China（No.61002007 ）

An Aptamer-based Fluorescence Biosensor for Insulin Detection Based on Graphene Oxide

JIANG Li-Ying*，XIAO Xiao-Nan，ZHOU Peng-Lei，ZHANG Pei，YAN Yan-Xia，JIANG Su-Xia，CHEN Qing-Hua （Zhengzhou University of Light Industry，Institute of Electrical and Information Engineering，Zhengzhou 450002 China）

By using fluorophore（FAM）labeled aptamers as recognition elements and graphene oxide as a quencher，a highly selective and sensitive sensor was constructed for the fast and accurate detection of insulin. After the aptamer binding with graphene oxide，fluorescence will be quenched and fluorescence intensity disappeared；after addition of insulin，the solution fluorescence was restored.Based on the fact，we established a method for the determination of insulin concentration by measuring the fluorescence intensity. The results showed that the concentration of insulin in the range of 5×10-8-1×10-5mol/L had a good linear relationship with the fluorescence intensity.The detection limit was 10 nmol/L.This method of detecting insulin had obvious advantages of fast detection speed，high selectivity and low detection limit.

Fluorophore；Aptamer；Graphene oxide；Fluorescence aptamer biosensor；Insulin

3 July 2015；accepted 13 November 2015）

10.11895/j.issn.0253-3820.150534

2015-07-03收稿；2015-11-13接受

本文系国家自然科学基金（No.61002007）、河南省科技创新人才计划（No.124100510001）、郑州轻工业学院2014年度研究生科技创新基金资助项目（No.2014010）、郑州轻工业学院博士科研基金资助项目（No.2014BSJJ041）

*E-mail：jiangliying@zzuli.edu.cn