超高效合相色谱-质谱法分析研究单甘酯乳化剂中单甘酯的主要组成

林春花刘德永范乃立夏剑辉廖维林（江西师范大学国家单糖化学合成工程技术研究中心，化学化工学院，南昌 33007）

超高效合相色谱-质谱法分析研究单甘酯乳化剂中单甘酯的主要组成

林春花1刘德永1范乃立1夏剑辉*2廖维林1
（江西师范大学国家单糖化学合成工程技术研究中心1，化学化工学院2，南昌 330027）

建立了超高效合相色谱-质谱（UPC2-MS）快速分析3种单甘酯乳化剂（单油酸甘油酯、单亚油酸甘油酯、单硬脂酸甘油酯）中单棕榈酸甘油酯、单硬脂酸甘油酯、单油酸甘油酯和单亚油酸甘油酯等4种主要的单甘酯的方法，并比较了这3种不同类别的乳化剂中此4种单甘酯的含量差异。采用正己烷/异丙醇（7∶3，V/V）直接溶解样品，以ACQUITY UPC2BEH 2-EP色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.7μm）为分析柱，以超临界CO2-甲醇/乙腈（1∶1，V/V）为流动相进行梯度洗脱，流速为1.0 mL/min。在电喷雾正离子模式下进行分析，外标法定量。结果表明：单棕榈酸甘油酯、单硬脂酸甘油酯、单亚油酸甘油酯在0.20～50 mg/L范围内具有良好线性，单油酸甘油酯在0.25～62.5 mg/L范围内具有良好的线性（相关系数不小于0.9983）；定量限（S/N≥10）为0.018～0.046 mg/L；在3个加标水平下，样品的回收率在88.0%～110.5%，相对标准偏差为1.1% ～4.1%。本方法简单、快速、分离效果好，无需对单甘酯样品进行衍生化，为乳化剂中单甘酯的含量分析提供了一种新的色谱技术手段。

超高效合相色谱-质谱法；单甘酯；乳化剂；未衍生化

1 引言

乳化剂是一种能改善乳化体中各种构成相之间的表面张力，稳定乳浊液的添加剂。单甘酯是食品行业重要的乳化剂［1］，按照主要组成脂肪酸（C16～C18）的名称可以将其分为单棕榈酸甘油酯、单硬脂酸甘油酯等饱和脂肪酸单甘酯和单油酸甘油酯、单亚油酸甘油酯等不饱和脂肪酸单甘酯［2，3］。一直以来，单甘酯的生产对象主要为饱和脂肪酸单甘酯，且单硬脂酸甘油酯使用的最多，它几乎成了单甘酯的代名词。近年来，研究发现不饱和脂肪酸单甘酯，具有更低的表面张力和更好的乳化能力［4，5］，是一种更为优良的食品乳化剂和保健食品添加剂。因此，对单甘酯乳化剂制品中单甘酯的主要组成进行分析，将有助于产品质量的提高以及食品安全风险的控制。

单棕榈酸甘油酯、单硬脂酸甘油酯、单油酸甘油酯和单亚油酸甘油酯等单甘酯结构类似，分子量相差不大，沸点较高。现有的分析方法有化学滴定法［6］、TLC［7］、GPC［8］、GC［9～12］、HPLC-UV/RID/ ELSD［4，13～16］等。化学滴定法易使单甘酯的测定结果偏高，且不适合对样品中存在不饱和脂肪酸单甘酯进行分析［15，17］；TLC操作简单，但定量分析不太准确［18，19］；GPC只能测定单甘酯总量，不能对上述4种单甘酯进行完全分离；GC是较常用的方法，直接分析样品时需要高温测试条件，色谱柱的使用寿命大大降低，而间接分析样品时需要进行衍生化处理，过程繁琐且影响产物的准确测定［20］；HPLC-ELSD法虽无需样品衍生化，但分析时间较长，检测限较高。近年来，随着UPLC色谱技术的发展，在一定程度上弥补了HPLC的不足。因此，建立一种更为简便且分离度更高的测定单甘酯的方法很有必要。

超高效合相色谱（UPC2）是基于超临界流体色谱（SFC）的基本原理而发展起来的一种新型色谱技术，它集合了SFC和UPLC两者的优势，开辟了分离科学的新领域［21］。分析现有研究成果发现，SFC是分析脂类物质方法中选择性较好的方法［22］。而UPC2继承和发展了SFC的优势，是新一代快速、准确分析单甘酯的技术手段。本研究就是利用UPC2对单甘酯乳化剂中4种主要的单甘酯进行分析测定，不但验证了UPC2方法的科学性和可行性，同时也为评价单甘酯乳化剂的品质提供了数据参考。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

ACQUITY UPC2系统（美国Waters公司），配Waters SQD 2质谱检测器。ACQUITY UPC2HSS C18SB色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.7μm）、ACQUITY UPC2BEH色谱柱（100 mm×3 mm，1.7μm）、ACQUITY UPC2BEH 2-EP色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.8μm）和ACQUITY UPC2CSHTMFluoro-Phenyl Column色谱柱（100 mm×3 mm，1.7μm）（美国Waters公司）。METTLER TOLEDO AL204型电子天平（瑞士METTLER公司）。PURELAB Ultra MK 2型超纯水仪（英国ELGA公司）。可调式移液器（上海大龙公司）。

4种单脂肪酸甘油酯标准品：单棕榈酸甘油酯、单硬脂酸甘油酯、单油酸甘油酯和单亚油酸甘油酯（纯度大于99%，Sigma Aldrich公司）；甲醇、乙腈、正己烷和异丙醇（色谱纯，德国Merck公司）；甲酸、甲酸铵（色谱级，上海安谱公司）；醋酸铵（色谱级，美国Fluka公司）；实验用水为超纯水。单硬脂酸甘油酯乳化剂、单油酸甘油酯乳化剂和单亚油酸甘油酯乳化剂均为市售。

2.2 实验条件

2.2.1 色谱条件色谱柱：ACQUITY UPC2BEH 2-EP；流动相：超临界CO2（A）和甲醇-乙腈（1∶1，V/V）（B）。洗脱梯度：0～2 min，3.5%～5%B；2～3 min，5%B；3～5 min，5%～12%B；5～6min，12%～3.5%B。柱温：45℃；样品室温度：10℃；背压：1.103×107Pa；流速：1.0 mL/min；进样体积：1 μL。

2.2.2 质谱条件离子源：ESI+；毛细管电压：3.0 kV；锥孔电压：30V；源温度：120℃；脱溶剂气温度：500℃；脱溶剂气体流速：800 L/h；锥孔气体流速：30 L/h；补偿溶剂：10 mmol/L甲酸铵溶液，流速为0.2 mL/min；选择离子监测模式下，单棕榈酸甘油酯、单硬脂酸甘油酯、单油酸甘油酯和单亚油酸甘油酯的m/z分别为348.50，376.56，374.54，372.56（［M+NH4］+），提取离子色谱图如图1所示。

图1 4种单脂肪酸甘油酯标准品在ESI+模式下的提取离子色谱图Fig.1 Extracted ion chromatograms of the four monoglyceride standards in ESI+mode

2.2.3 混合标准溶液的配制分别准确称取单棕榈酸甘油酯、单硬脂酸甘油酯、单油酸甘油酯和单亚油酸甘油酯标准品，用正己烷/异丙醇（7∶3，V/V）溶解，依次配成浓度为1.000 g/L，1.000 g/L，1.250 g/L，1.000 g/L的单一标准品储备液。移取不同体积的各单甘酯标准溶液混合配制成混合标准溶液，再稀释成系列标准工作溶液。

2.2.4 样品制备分别称取0.01 g（精确至0.0001 g）单硬脂酸甘油酯乳化剂、单油酸甘油酯乳化剂和单亚油酸甘油酯乳化剂等样品，用正己烷-异丙醇（7∶3，V/V）溶解并定容至100 mL，经有机膜过滤后待测。

3 结果与讨论

3.1 色谱柱的选择

UPC2系统可以使用传统正相和反相色谱柱的填料，为开发分离方法提供了多种选择性。本实验首先考察了4种不同填料的ACQUITY UPC2色谱柱对单甘酯分离的影响，它们分别为BEH，BEH 2-EP，HSS C18SB及CSHFluoro-Phenyl。由图2可见，除HSS C18SB柱外，其它色谱柱的出峰顺序相似。BEH柱和BEH 2-EP柱对单甘酯混合物的选择性最好，都能够实现4种单甘酯的有效分离。但BEH 2-EP柱的极性小于BEH柱，更适合分离极性较大的单甘酯混合物，具有较理想的分析时间和选择性，因此本实验选用BEH 2-EP色谱柱。

图2 不同色谱柱对4种单脂肪酸甘油酯分离效果的影响Fig.2 Effect of different chromatographic columns on the separation of four monoglycerides Peaks：1.1-Monopalmitin；2.1-Monostearin；3.1-Monoolein；4.1-Monolinolein.

3.2 洗脱梯度的选择

洗脱梯度的变化会对目标物的保留时间和分离度产生一定的影响。本实验考察了3组不同的洗脱梯度的方法（方法1：0～2 min，1.5%～5%B；2～3 min，5%～12%B；3～4 min，12%B；4～6min，12% ～1.5%B，方法2：0～2 min，3.5%～5%B；2～3 min，5%B；3～5 min，5%～12%B；5～6 min，12%～3.5%B，方法3：0～2 min，3.5%～12%B；2～3 min，12%B；3～6 min，12%～3.5%B）。由图3可见，共溶剂中流动相B的含量越高，保留时间越短（方法1＞方法2＞方法3）；洗脱梯度的斜率越大，分离度越小（方法2＞方法1＞方法3）。综合考虑分离度和保留时间，最终选用方法2的洗脱梯度。

3.3 柱温的选择

改变柱温会在一定程度上影响UPC2的分离效果，所以实验中以混合标准品为对象，在改性剂为甲醇-乙腈（1∶1，V/V）、流速为1.0 mL/min和背压1.103×107Pa的条件下，考察柱温（35℃，45℃，55℃）对分离效果的影响。由图4可见，随着柱温升高，目标物的保留增大，这是因为升高温度会降低CO2的密度，从而减弱其洗脱能力，导致化合物的保留值增大；同时目标物的分离度随着温度的升高而有所增加，当升高至55℃时增幅不大，因此选用45℃柱温。

图3 不同的洗脱梯度对4种单甘酯分离度和保留时间的影响Fig.3 Effect of elution gradients on resolution and retention time of four monoglycerides

图4 温度对4种单干酯分离效果的影响Fig.4 Effect of temperature on the separation of four monoglycerides

3.4 背压的选择

背压的改变也会在一定程度上影响UPC2的分离效果，所以在改性剂为甲醇-乙腈（1∶1，V/V）、流速1.0 mL/min和柱温45℃的条件下，考察了不同的系统背压（1.103×107～1.378×107Pa）对分离效果的影响。结果如图5所示，背压升高造成CO2的密度和黏度增加，从而导致流动相的溶剂化能力和洗脱能力提高，进而使得化合物的保留时间缩短；同时，背压升高对分离度影响不大。因此，选择背压为1.103×107Pa时，目标物的分离效果与保留效果较好。

3.5 MS中补偿溶剂的选择

在LC-MS分离中，一般会使用补偿溶剂，以改善峰形和促进目标物的分子离子化。在相同的梯度洗脱条件下，流速为0.2 mL/min时，实验考察了分别含0.1%（V/V）甲酸、10 mmol/L甲酸铵和10 mmol/L醋酸铵的甲醇作为补偿溶剂时4种单甘酯的分离情况。由图6可见，使用甲酸铵、醋酸铵等缓冲盐作补偿溶剂，总离子流图（TIC）的响应值分别为1.40×108和1.33×108，明显高于使用甲酸的补偿溶剂。因此，最终选用甲醇-10 mmol/L甲酸铵作为补偿溶剂，目标物的离子化效率最好，响应灵敏度最高。

图5 背压对4种单干酯分离效果的影响F i g . 5 E f f e c t o f b a c k p r e s s u r e o n t h e s e p a r a t i o n o f f o u r m o n o g l y c e r i d e s

图6 补偿溶剂对4种单干酯分离效果的影响Fig.6 Effect of compensation solvent on the separation of the four monoglycerides

3.6 方法评价

配制不同质量浓度的混合标准溶液，在优化的色谱条件下进行检测，以峰面积（y）对质量浓度（x，mg/L）进行线性回归，得到线性回归方程。向已知含量的乳化剂样品中分别添加4种成分的单甘酯标准品，设置3个添加水平，每个加标水平重复测定6次，并计算加标回收率和精密度。按信噪比S/N≥10计算得到分析方法的定量限（LOQ）。结果（表1）表明，单棕榈酸甘油酯、单硬脂酸甘油酯、单亚油酸甘油酯在0.20～50.0 mg/L内线性关系良好，而单油酸甘油酯在0.25～62.5 mg/L内线性关系良好（R2≥0.9983），3个加标水平的回收率在88.0%～110.5%，RSD为1.1%～4.1%，LOQ为0.018～0.046 mg/L，可满足食品乳化剂中单甘脂的测定要求。

表1 4种单脂肪酸甘油酯的方法评价结果Table 1 Evaluation of the method for the 4 monoglycerides

运用本方法对市售的3种单甘酯乳化剂（单硬脂酸甘油酯乳化剂、单油酸甘油酯乳化剂、单亚油酸甘油酯乳化剂）样品进行检测（表2），结果表明，3种单甘酯乳化剂中4种1-单甘酯的含量和比例因类别不同而差异较大。其中，单油酸甘油酯乳化剂和单亚油酸甘油酯乳化剂都是以1-油酸单甘酯和1-亚油酸单甘酯等不饱和1-单甘酯为主，它们在上述2种乳化剂中的总含量分别为71.73%和85.92%。单硬脂酸甘油酯乳化剂是以1-单棕榈酸和1-单硬脂酸甘油酯等饱和1-单甘油酯为主，它们在该乳化剂中的总含量高达91.01%。3种样品的色谱图如图7所示。

表2 实际样品的分析结果Table 2 Analytical results of real sample

图7 单硬脂酸甘油酯乳化剂（a）、单油酸甘油酯乳化剂（b）、单亚油酸甘油酯乳化剂（c）中4种单甘酯的色谱图Fig.7 UPC2chromatograms of 4 monoglycerides in the monostearin emulsifier（a），monoolein emulsifier（b）and monolinolein emulsifier（c）

4 结论

通过对色谱柱、洗脱梯度、柱温、背压、补偿溶剂等条件的优化和考察，建立了超高效合相色谱-质谱法快速分析单甘酯乳化剂中4种单甘酯的分析方法。本方法采用超临界CO2作为主要流动相，它具有与液体相近的密度、与气体接近的粘度及扩散系数等优良性能。同以往色谱分析方法相比，本方法获得了灵敏度更高和分析速度更快的结果，为快速、准确分析单甘酯的主要组成提供了新的技术手段，同时也为评价单甘酯乳化剂的品质提供了数据参考。

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2.1.2 料液比 一般情况下，在料液比较大时花青素提取效果较好。山竹果皮花青素提取量随料液比升高而降低，而溶液中花青素含量随料液比升高而升高。花青素提取量曲线与溶液中花青素含量曲线出现一个交点，此时，料液比为1∶28。当料液比过大时则会造成不必要的溶剂浪费和能源消耗，故正交试验料液比选用1∶25～1∶35。

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This work was supported by the National Science and Technology Support Project（Nos.2012BAE07B00，2014BAE13B02 ）

Determination of Main Composition of Fatty Acid Monoglyceride in Monoglyceride Emulsifier Using Ultra Performance Convergence Chromatography-Mass Spectrometry

LIN Chun-Hua1，LIU De-Yong1，FAN Nai-Li1，XIA Jian-Hui*2，LIAO Wei-Lin1
（National Monosaccharide Chemical Synthesis Engineering Research Center1，Chemistry and Chemical Engineering Department2，Jiangxi Normal University，Nanchang 330027，China）

A fast analytical method was developed for the determination of main composition of fatty acid monoglycerides，including monopalmitin，monostearin，monoolein and monolinolein，in monoglycerede emulsifiers by ultra-performance convergence chromatography-massspectrometry. Theircontentswere compared in the 3 emulsifiers from different sources.The sample was directly dissolved with n-hexane/isopropanol（7∶3，/V）The chromatographic separation was performed on the ACQUITY UPC2BEH 2-EP column（2.1 mm×100 mm，1.7μm）using the mobile phases of carbon dioxide and methanol/acetonitrile （1∶1，V/V）solution with gradient elution.The separated compounds were detected by MS detector in positive electrospray ionization（ESI+）and quantified by external standard method.The results showed that the calibration curves of monopalmitin，monostearin，monoolein and monolinolein were linear in the range of 0.20-50 mg/L，0.20-50 mg/L，0.25-62.5 mg/L and 0.20-50 mg/L，respectively，with correlation coefficients not less than 0.9983.The limits of quantification（S/N≥10）of the four fatty acid monoglycerides were 0.018-0.046 mg/L.The average recoveries for the four monoglycerides at three spiked levels were 88.0%-110.5%with relative standard deviations of 1.1%-4.1%.The proposed method showed high performance，good selectivity and fast analysis for the underivatized monoglyceride samples.It would provide a new chromatographic technology for the content analysis of monoglycerides in the emulsifier.

Ultra-performance convergence chromatography-mass spectrometry；Fatty acid monoglyceride；Emulsifier；Underivatization

14 July 2015；accepted 21 October 2015）

10.11895/j.issn.0253-3820.150558

2015-07-14收稿；2015-10-21接受

本文系国家科技支撑计划项目（Nos.2012BAE07B00，2014BAE13B02）资助

*E-mail：xjh2168@126.com