PKB/Akt通过Girdin蛋白调控小鼠受精卵微丝聚集

武迪迪，张盼盼，刘莹，于秉治



PKB/Akt通过Girdin蛋白调控小鼠受精卵微丝聚集

武迪迪1，张盼盼2，刘莹1，于秉治1

1 中国医科大学生物化学与分子生物学教研室, 辽宁沈阳110001 2 沈阳市第五人民医院, 辽宁沈阳 110001

通过研究PKB/Akt与Girdin蛋白之间的关系，目的在于揭示Girdin蛋白在PKB/Akt调控小鼠受精卵微丝聚集中的作用。研究中首先结合软件 (http：//scansite.mit.edu//) 预测了PKB/Akt对Girdin蛋白的磷酸化位点，并制定特定位点磷酸化抗体，通过蛋白免疫印迹检测经PKB/Akt mRNA或PKB/Akt siRNA处理后的小鼠受精卵中Girdin蛋白磷酸化改变情况。同时检测了磷酸化的Girdin蛋白亚细胞定位及同微丝骨架的定位关系。进一步通过显微注射PKB/Akt mRNA再注射Girdin siRNA检测小鼠受精卵微丝骨架的聚集。结果显示经持续激活型PKB/Akt mRNA、野生型PKB/Akt mRNA处理后的小鼠受精卵中p-Girdin-1 417分布位置更加集中在2-细胞分裂沟处。经野生型和持续激活型PKB/AktmRNA注射组p-Girdin-1 417表达增强，但是并不影响Girdin蛋白的总的表达。说明siRNA介导的PKB/Akt表达敲低非常明显地降低了Girdin蛋白的磷酸化。激光共聚焦研究显示在Akt mRNA和Girdin siRNA共注射组微丝骨架分布明显散乱。本研究结果充分说明Girdin蛋白在小鼠受精卵中受到PKB/Akt的调节，PKB/Akt通过磷酸化Girdin蛋白改变微丝骨架的聚集。

PKB/Akt，Girdin蛋白，F-actin，小鼠受精卵

微丝骨架(Microf ilament cytoskeleton) 在受精卵早期分裂及发育中对精卵融合、纺锤体旋转、分裂沟形成及胞质分裂等事件的完成发挥重要作用[1]。但在哺乳动物尤其在小鼠受精卵细胞的分裂及早期发育过程中，微丝骨架形成和变化的调控因子及信号调控机制尚不清楚。

蛋白激酶B (Protein kinase B，PKB) 是一种丝/苏氨酸蛋白激酶，与v-基因编码的Akt蛋白同源，又被称为Akt。PKB/Akt主要通过PI3K途径调节细胞多种生理功能，并被确定为参与肿瘤侵袭和转移的重要信号途径[2-4]。研究报道显示敲低PKB/Akt表达能够抑制神经胶质瘤细胞的迁移和侵袭。进一步研究发现PKB/Akt参与乳腺癌细胞迁移同微丝骨架的重新构建密切相关[5-7]。而我们的前期研究发现PKB/Akt在小鼠卵母细胞及早期受精卵中存在且能够促进受精卵的分裂[8-9]。并进一步发现PKB/Akt在小鼠卵母细胞及受精卵一、二细胞期中同微丝骨架存在着共定位。同时我们也已证明PKB/Akt可影响小鼠受精卵细胞微丝骨架的正确聚集及分布[10-11]。

上述研究虽然初步证明了PKB/Akt可以影响小鼠受精卵微丝骨架的聚集，但是其作用途径还很不明确。多项研究显示微丝骨架可受到多种微丝交联/成束蛋白调控，包括fimbrin、villin、scruin、fascin、families和Girdin蛋白等的影响。其中Girdin (Girders of actin filaments) 是一个新近发现参与微丝交联的PKB/Akt底物蛋白，也被称为APE (Akt phosphorylation enhancer)、GIV (Gα-interacting vesicle associated protein)。其在多种类型癌细胞及未成熟的血管内皮细胞中表达，参与多种细胞进程，包括重新构建微丝骨架、内吞作用，最终导致癌症的侵袭和血管的再生[12-13]。Girdin蛋白最早是通过酵母双杂交方法作为PKB/Akt连接蛋白而被发现的。研究显示在多种类型的生长因子刺激下，PKB/Akt能够磷酸化Girdin蛋白C-末端区域的ser-1416位点，使其在细胞迁移过程中细胞骨架的重构扮演重要角色。Girdin蛋白仅同Akt的C末端连接但是不能同其他AGC家族成员包括蛋白激酶C和SGKs相结合。表明Girdin仅参与了PKB/Akt信号途径[14]。最新研究发现，PKB/Akt依赖的Girdin磷酸化过程调节了急性心肌梗死的修复[15]。在小鼠中PKB/Akt介导的磷酸化Girdin蛋白对肿瘤相关的成纤维细胞 (CAF) 的侵袭和肿瘤细胞的生长也起很重要的作用[16]。然而，关于Girdin蛋白在小鼠受精卵早期分裂中同PKB/Akt的相互关系，国内、外文献却未见报道。我们根据Scansite软件(http://scansite.mit.edu) 预测了PKB/Akt和鼠Girdin蛋白的相关位点。结果发现鼠在1 417位有一个丝氨酸残基，而这一位点恰恰和人Girdin 蛋白丝氨酸1 416位点相一致。结合Girdin蛋白在小鼠受精卵中的研究空白及其在肿瘤细胞中的作用，进而提出假设：即PKB/Akt通过磷酸化Girdin蛋白参与调节小鼠受精卵早期发育微丝骨架的形成和分布，从而调节小鼠受精卵早期的发育。我们大胆推测PKB/Akt蛋白能够使Girdin蛋白磷酸化，磷酸化的Girdin蛋白从质膜上分离，牵引着微丝聚集在受精卵分裂处，参与形成溢缩环，并且磷酸化的Girdin蛋白同PKB/Akt结合促进PKB/Akt锚定于细胞质膜上，进而维持PKB/Akt蛋白高催化活性，促进受精卵的分裂。但是具体机制需要相应实验进行验证。因此，我们认为十分有必要对Girdin蛋白同PKB/Akt的关系进行更深一步的研究。

本研究中，在预测了小鼠受精卵中PKB/Akt和鼠Girdin蛋白的相关位点的基础上，通过实验证明了过表达PKB/Akt蛋白能够促进Girdin蛋白的磷酸化，而敲低PKB/Akt蛋白表达则抑制Girdin蛋白磷酸化。更进一步，通过共注射激活型PKB/Akt 及Girdin siRNA检测小鼠受精卵发育及微丝聚集变化情况，进一步明确Girdin在PKB/Akt调控小鼠受精卵微丝聚集中的作用。为深入探讨小鼠受精卵早期发育中PKB/Akt与Girdin及微丝之间的关系、阐明小鼠受精卵早期发育的分子机理有十分重要的意义。

1 材料与试剂

中国医科大学实验动物部提供昆明系SPF级雌 (4–5周，16–18 g)、雄 (8周，30–35 g) 小白鼠 (许可证号：SCXK (辽宁) 2008–0005) Girdin抗体 (Santa cruz)；Girdin siRNA (Santa cruz)；Akt siRNA (m) sc-19169 (Santa cruz)；pcDNA-Akt-WT、pcDNA-Akt-KD、pcDNA-myr-Akt由本研究室构建并保存；TRITC-phalloidin (Invitrogen公司)；mMESSAGE mMACHINE T7 Ultra kit体外转录试剂盒 (Ambion公司)；小鼠Girdin-S1 417磷酸化抗体和非磷酸化抗体由中国南京川博生物技术有限公司合成；辣根过氧化酶二抗、FITC/TRITC荧光二抗 (北京中山金桥)；蛋白裂解液、ECL发光试剂盒 (碧云天公司)；快速微量mRNA提取纯化试剂盒 (GE healthcare公司)；反转录酶、RNA酶抑制剂 (Promega公司)；Hoechst33258、透明质酸酶、M2培养液、M16培养液、BSA (Sigma公司)；LB培养基 (invitrogen公司)；大肠杆菌DH5α感受态细菌、限制性内切酶 (Takara公司)；去内毒素质粒中量提取试剂盒 (OMEGA公司)；孕马血清促性腺激素、人绒毛膜促性腺激素 (宁波第二激素厂)；其他试剂为国产分析纯。

2 方法

2.1 小鼠超排卵及受精卵的采集

昆明系SPF级4–5周龄性成熟雌鼠(18–22 g)，腹腔注射PMSG 10 IU/只，46–48 h后腹腔注射hCG 10 IU/只，当晚与8周龄以上性成熟雄性昆明系SPF级小鼠(30–35 g) 合笼过夜。次日检测阴栓，有阴栓者视为交配成功。脱颈椎法处死雌鼠，取双侧输卵管，剪下置于M2培养液中，在实体镜下撕开壶腹部，让细胞团自然流出，透明质酸酶 (300 μg/mL，溶于M2培养液中) 5–10 min去除颗粒细胞，在M2培养液中洗3次，加入200 μL预先在培养箱中平衡的M16培养液，上覆矿物油，在37 ℃、5% CO2、饱和湿度的CO2培养箱内培养至指定时间点进行收集或进行实验。受精卵培养及收集时间按照冷泉港-小鼠胚胎实验操作手册进行。

2.2 小鼠蛋白的PKB/Akt作用靶位点的确定

将小鼠Girdin蛋白序列(Q5SNZ0) (GenBank Accession No. AB087827) 输入Scansite分析软件中，分析并预测Girdin蛋白中的ser1 417位点为可能的磷酸化位点，并且这个位点符合PKB/Akt作用的一致序列RXRXX (S/T)。根据预测的位点进行特异位点磷酸化抗体的制备。

2.3 体外转录

将已有的野生型、激酶激活型和失活型PKB/Akt的pcDNA3.1/myc-his表达载体进行体外转录，制备野生型、磷酸化位点突变型激酶激活型和失活型PKB/Akt的mRNA，纯化mRNA并进行浓度测定(Myr-Akt代表激酶激活型、KD-Akt是激酶失活型、WT-Akt为野生型)。体外转录应用的是Ambion公司的mMESSAGE mMACH INE体外转录试剂盒，方法参照试剂盒说明书。

2.4 显微注射

显微注射应用Eppendorf Transferman显微操作系统，OlympusIX-70 倒置显微镜，DIC调制相差观察。显微注射在M2液滴中进行。为尽量减少显微注射对受精卵的影响，一般注入到受精卵内的样品体积为10 pl (相当于其总体积的5%)。mRNA溶解于无核酸酶污染的5 mmol/L Tris和0.5 mmol/L EDTA (pH 7.4) 中，稀释成不同浓度，对照组为非注射组及注射TE缓冲液组。用DEPC处理水溶解Girdin siRNA，稀释成不同浓度。

2.5 Western印迹法检测蛋白表达

分别收集经各种处理后的小鼠受精卵250个；在蛋白裂解液 (20 μL) 中经反复冻融3次后，加入蛋白上样缓冲液，100 ℃煮沸5 min，瞬时离心后上样，以12%或10% SDS-PAGE电泳分离，转印至PVDF膜，5%脱脂奶粉室温封闭1 h，分别与Girdin-Ser1417磷酸化或非磷酸化抗体、PKB/Akt抗体及β-actin抗体 (1∶1 000) 4 ℃结合过夜。TBST洗涤3次后，分别与相应的HRP偶联二抗室温孵育1 h，TBST洗膜3次，用ECL化学发光法显影。UVP凝胶成像系统扫描成像图像分析软件分析灰度值。以目标蛋白与α-tublin的灰度值比值计算各组相对表达量。每组实验重复3次。

2.6 微丝的免疫荧光化学

收集经各种处理后的小鼠受精卵移入4%多聚甲醛中37 ℃固定40 min或4 ℃固定过夜。将固定后的样品移入清洗液 (含0.1% BSA的DPBS) 中清洗3次，每次5 min。将清洗后的样品移入透膜液 (清洗液中加入0.2% TritonX-100)，在37 ℃温箱中温育40 min，增加细胞膜的通透性，以利于抗体进入。透膜处理后的样品移入清洗液中洗3次，每次5 min；每毫升清洗液中添加0.125 g甘氨酸和10 mg BSA作为封闭液，37 ℃温育l h。样品放入l∶100封闭液稀释的小鼠抗girdin或Akt抗体中，37 ℃温育l h。清洗液清洗3次，每次5 min。样品与1∶100清洗液稀释的FITC标记的抗兔二抗37 ℃温育40 min，未经一抗处理、只做二抗结合的样品作为阴性对照。在含有300 U/mL罗丹明标记的鬼笔环肽(TRITC- phalloidin) 的DPBS溶液中，37 ℃共同温育 40 min，进行微丝F-actin染色，用清洗液清洗3次，每次5 min。将经过微丝染色的样品清洗后，在含有(Hoechst33258) 的清洗液中室温下温育5–10 min。在洁净的载玻片上加一滴防荧光淬灭剂DABCO，将处理好的卵转移其中，封片后置于暗盒，低温保存，尽快用激光共聚焦显微镜观察、照相。每组实验重复3次，每次至少观察30个样品。

2.7 激光共聚焦显微镜成像分析

TRITC 545 nm，Hoechst33258所用激发波长为352 nm，在图象分析系统中选择目标区域取图，并做Z轴方向的光切片合成。

3 结果与分析

3.1 小鼠Girdin蛋白的PKB/Akt作用靶位点的确定

将小鼠Girdin蛋白序列(Q5SNZ0) 输入Scansite分析软件中，根据评分 (0.481 2) 及序列 (INRERQKSLTLTPTR) 分析并预测PKB/Akt的作用位点。结合已有的文献，最后确定小鼠Girdin蛋白中的ser1 417位点为可能的磷酸化位点，并且这个位点符合PKB/Akt作用的一致序列RXRXX (S/T)。

3.2 PKB/Akt影响Girdin蛋白的磷酸化

取小鼠G1期受精卵显微注射野生型和持续激活型PKB/Akt的mRNA或利用siRNA沉默PKB/Akt蛋白编码基因，通过激光共聚焦显微镜观察经持续激活型PKB/Akt mRNA、野生型PKB/Akt mRNA、激酶失活型PKB/Akt mRNA及PKB/Akt siRNA处理后小鼠受精卵中p-Girdin-1 417及F-actin的定位状态。结果显示，对照组中p-Girdin-1 417弥散分布在胞浆中，而经持续激活型PKB/Akt mRNA、野生型PKB/Akt mRNA处理后的小鼠受精卵中FITC标记的p-Girdin-1 417荧光信号较对照组及PKB/Akt siRNA处理组明显增强，并且分布位置更加集中在2-细胞分裂沟处，进一步观察发现微丝的荧光信号也在分裂沟处增强，这也说明磷酸化的Girdin蛋白可能参与了微丝的聚集 (图1)。进一步通过免疫印迹检测Girdin的1 417位磷酸化及Girdin蛋白的总表达情况。结果显示野生型和持续激活型PKB/Akt的mRNA注射组Girdin的ser1 417位磷酸化增强但是并不影响Girdin蛋白的总的表达。siRNA介导的PKB/Akt表达敲除非常明显地降低了Girdin的磷酸化水平(图2)。结果说明PKB/Akt可磷酸化小鼠受精卵中Girdin蛋白的1 417位丝氨酸。

图1 PKB/Akt影响磷酸化Girdin蛋白定位

图2 PKB/Akt影响Girdin蛋白磷酸化

3.3 小鼠受精卵中微丝重构及分布与PKB/Akt、Girdin之间的关系

在进一步的研究中我们首先用myr-Akt mRNA处理小鼠G1期受精卵，随后再注射Girdin siRNA。M16培养液中37 ℃、5% CO2培养箱中培养，20 h后取出进行微丝染色。通过激光共聚集荧光显微镜观察每一组卵细胞的微丝聚集状态。正如我们所预期，在Akt mRNA和Girdin siRNA共注射组微丝荧光信号出现了明显的降低，并且干扰了微丝的正确聚集 (图3)。说明PKB/Akt可通过作用Girdin蛋白影响微丝聚集。

图3 PKB/Akt通过Girdin蛋白调控小鼠受精卵微丝聚集

4 讨论

Girdin蛋白最早是通过酵母双杂交方法作为PKB/Akt连接蛋白而被发现的。有文献研究表明PKB/Akt可磷酸化Girdin的serine1 416位，磷酸化的Girdin使微丝从质膜上分离，随后聚集在迁移细胞边缘，导致微丝骨架的重新排列影响细胞的运动[14]。多项研究表明Girdin在肿瘤细胞的迁移、侵润和转移中都扮演重要角色[17-20]。新近研究发现，Girdin蛋白通过PI3K-Akt途径调控胶质瘤细胞的迁移及侵袭[21]。也有研究小组提出Girdin蛋白可增强PKB/Akt活性调控DNA合成[22]。而Cenni等则提出PKB/Akt可直接作用于微丝[23]。然而，关于PKB/Akt调控小鼠受精卵微丝的聚集过程是否通过Girdin蛋白的作用还未见报道。

本实验研究结果显示PKB/Akt能够磷酸化Girdin蛋白的Ser-1 417位点，用phospho-Ser-1 417抗体检测发现在野生型Akt mRNA及激活型Akt mRNA处理后的小鼠受精卵中Girdin蛋白呈磷酸化状态，而Akt siRNA处理后阻止了Girdin的磷酸化。激光共聚焦观测显示，同非磷酸化的Girdin蛋白相比较，磷酸化的Girdin蛋白突出显现在受精卵卵裂沟处。上述结果说明PKB/Akt能通过调控Girdin蛋白的磷酸化，通过亚细胞定位发现能够促进小鼠受精卵细胞的分裂。我们分析磷酸化的Girdin蛋白从质膜上分离，牵引着微丝聚集在受精卵分裂处，参与形成溢缩环，进而促进受精卵的分裂。为了进一步明确PKB/Akt同Girdin蛋白的调控关系，我们采取激活型Akt mRNA和Girdin siRNA共注射的方法检测受精卵中微丝聚集改变情况。结果显示在Akt mRNA和Girdin siRNA共注射组微丝荧光信号在二细胞分裂沟处出现了明显的降低，显示微丝的正确聚集受到影响。综上结果，我们认为在小鼠受精卵中PKB/Akt通过磷酸化Girdin蛋白改变微丝的聚集进而影响受精卵早期的正常卵裂。

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(本文责编 郝丽芳)

PKB/Akt regulates the aggregation of actin by girdin in mouse fertilized eggs

Didi Wu1, Panpan Zhang2, Ying Liu1, and Bingzhi Yu1

1 Department of Biochemical and Molecular Biology, China Medical University, Shenyang 110001, Liaoning, China 2 The Fifth People's Hospital of Shenyang, Shenyang 110001, Liaoning, China

The purpose of this study is to reveal the role of Girdin in regulating the aggregation of actin filaments by studying the relationship between PKB/Akt and Girdin. Firstwe used Scansite software (http://scansite.mit.edu) to predict relevant target sites of PKB/Akt on mouse Girdin. To gain insight into the role of phosphorylation of Girdin by PKB/Akt, we assessed the location of phosphorylated Girdin in fertilized eggs by staining with anti-P-Girdin 1 417 Ab. We detected a distinct increase in the fluorescence signal of F-actin and P-Girdin 1 417 after microinjection of Akt WT and myr-Akt. The addition of myr-Akt induced phosphorylation of Girdin in mouse fertilized eggs. In addition, siRNA-mediated Akt-knockdown blocked phosphorylation of Girdin. The distribution of actin filaments was obviously scattered. These results strongly suggest that PKB/Akt could directly phosphorylate Girdin on Ser1 417 and promote its function in mouse fertilized eggs.

PKB/Akt, Girdin, F-actin, mouse fertilized eggs

January 12, 2016; Accepted: April 27, 2016

Supported by:National Nature Science Foundation of China (Nos. 31501162, 81270654, 31570819).

Bingzhi Yu. E-mail: ybzbiochem@yeah.net Ying Liu. E-mail: yliu@mail.cmu.edu.cn

国家自然科学基金(Nos. 31501162，81270654，31570819) 资助。

武迪迪, 张盼盼, 刘莹, 等. PKB/Akt通过Girdin蛋白调控小鼠受精卵微丝聚集. 生物工程学报, 2016, 32(9): 1204–1211.

Wu DD, Zhang PP, Liu Y, et al. PKB/Akt regulates the aggregation of actin by girdin in mouse fertilized eggs. Chin J Biotech, 2016, 32(9): 1204–1211.