定点突变改造提高纺锤形赖氨酸芽孢杆菌氨基甲酸乙酯水解酶稳定性

刘晓慧，方芳，夏小乐，堵国成，陈坚,3,4



定点突变改造提高纺锤形赖氨酸芽孢杆菌氨基甲酸乙酯水解酶稳定性

刘晓慧1,2，方芳1,2，夏小乐1，堵国成2,3,4，陈坚1,3,4

1 江南大学生物工程学院工业生物技术教育部重点实验室，江苏无锡 214122 2 食品安全与营养协同创新中心，江苏无锡 214122 3 江南大学糖化学与生物技术教育部重点实验室，江苏无锡 214122 4 江南大学粮食发酵工艺与技术国家工程实验室，江苏无锡 214122

氨基甲酸乙酯 (ethyl carbamate，EC) 是一种存在于发酵食品和酿造酒精饮料中的潜在致癌物质。利用生物酶法去除食品饮料中的EC是一种较为安全有效的方法。本研究以来源于赖氨酸芽孢杆菌SC02的氨基甲酸乙酯水解酶为研究对象，采用计算机辅助设计突变位点，构建了其不稳定区域Q328位点的饱和突变体。通过酶学性质分析发现，突变体Q328C和Q328V在40 ℃下的半衰期分别提高了7.46和1.99倍，Q328R在高温下也有比原酶更好的耐受性。此外，突变体Q328C对乙醇的耐受性和酸耐受性也有所提高。对氨基甲酸乙酯水解酶分子改造的结果表明，通过改造其不稳定区域Q328位点，可以提高酶的热稳定性及对酸和乙醇的耐受性。

定点突变，氨基甲酸乙酯水解酶，氨基甲酸乙酯，酶稳定性

氨基甲酸乙酯 (Ethyl carbamate，EC) 是发酵食品 (酱油、腐乳、泡菜) 和酒精饮料 (葡萄酒、黄酒、白酒) 在生产、储藏过程中生成的对人体具有潜在致癌性和遗传毒性的一种微量有害物质[1-3]。2007年，国际癌症研究机构 (International Agency for Research on Cancer，IARC) 正式将其致癌级别由2B类提高为2A类[4]。因此，控制食品饮料中EC的含量，对保障食品安全至关 重要。

目前对食品及饮料中氨基甲酸乙酯的控制策略主要包括：改造发酵菌株来减少EC前体物质的生成[5]、向发酵食品中添加脲酶[6]、改善传统发酵工艺条件[7-8]等。由于EC的生成机制复杂，性质稳定一旦生成很难用物理或化学方法去除，目前还没有可以消除不同发酵产品中EC的一种有效方法。应用生物酶法去除成品中的EC是一种较为安全有效的方法[9-11]。氨基甲酸乙脂水解酶 (Urethanase，UH) 能够降解EC，生成无害的乙醇、二氧化碳和氨，具有潜在的工业应用价值。

目前对氨基甲酸乙酯水解酶的研究主要集中在新菌株的筛选以及对酶的酶学性质研究和应用上。Mohapatra等从海绵体中分离得到1株产UH酶的微球菌，其最佳pH值和温度分别为4.5及37 ℃[9]。Zhao等筛选到1株产UH酶的地衣芽孢杆菌，此酶对黄酒中的EC具有一定降解效果，其最适反应pH为4.5，在37 ℃、20%乙醇条件下保存2 h，酶活剩余64%[12]。Zhou等筛选到1株产中性EC酶的变幻青霉菌，能降低黄酒中的EC含量而不影响黄酒的风味[13]。目前对UH的基因序列报道较少，仅有Kambe等从马红球菌中得到一段编码UH的基因，并在大肠杆菌中实现了异源表达[14]。李京京等筛选到1株产UH的赖氨酸芽孢杆菌SC02，并将得到的编码UH的基因 (ID：KU353448) 在大肠杆菌中实现了异源表达[15]。但此酶为中性酶，在大肠杆菌中表达后酶的稳定性较差。定点突变是改善酶分子特性的一个主要方法[16-17]。本研究针对UH酶热不稳定等问题，通过计算机辅助设计突变位点，以期获得性质改良的突变酶，为促进UH酶在降解发酵类食品中的EC提供技术手段，为深入研究UH蛋白的结构与功能提供有利的参考数据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种和质粒

大肠杆菌BL21 (DE3)、含有编码UH基因的质粒pET20b-UH均为本实验室保存。

1.1.2 培养基

LB培养基(g/L)：蛋白胨10，酵母粉5，氯化钠10；固体培养基加入2.0% (/) 的琼脂。

TB液体培养基 (g/L)：甘油5，蛋白胨12，酵母粉24，磷酸二氢钾2.32，三水合磷酸氢二钾16.43。

1.1.3 主要试剂

DNA分子量标准和磷酸化酶购自宝生物工程(大连) 有限公司；氨苄青霉素、细菌基因提取试剂盒和PCR引物购自生工生物工程(上海) 股份有限公司；DNA胶回收试剂盒购自Omega 公司；NuPAGE预制凝胶购自Life Technologies公司；酵母粉、蛋白胨购自Oxoid公司。

1.2 基于计算机辅助方法设计突变位点

1.2.1 UH蛋白三维结构的同源建模

以PDB数据库中同源性较高的模板分别建模，选取覆盖率最高、gap较少、综合评分最高且同源性排第3 (37.58%) 的Glutamyl-tRNA (Gln) amidotransferase subunit A (PDB ID: 2G5H) 为模板，用在线三维结构模拟程序SWISS-MODEL (http://swissmodel.expasy.org/ interactive) 对UH蛋白进行三维结构建模。

1.2.2 B-factors值预测

本研究采用FlexServ软件(http://mmb.p cb.ub.es/FlexServ/input.php) 对UH不稳定区域B-factor值进行分析。

1.2.3 分子动力学模拟预测

本研究使用分子动力学软件Gromacs (http://www.gromacs.org/) 预测UH蛋白的RMSD及原子的RMSF值[18]。

1.2.4 预测蛋白质折叠自由能变化

本研究中通过软件PoPMuSiC-2.1 (http://dezyme.com/) 分析提高蛋白酶热稳定性的潜在突变位点[19]。其中该软件是基于突变体折叠自由能 (DDG) 的变化值来进行分析的。

1.3 定点突变

本研究中对基因的定点突变采用重组质粒pET20b-UH全序列扩增的方法。PCR条件： 95 ℃3 min；95 ℃30 s，55 ℃30 s，68 ℃ 2.5 min，30个循环；68 ℃5 min。PCR引物序列参见表1。获得的重组质粒送上海生物工程有限公司测序验证。

表1 突变引物

1.4 重组工程菌培养及UH酶诱导表达

将大肠杆菌重组工程菌接种到LB培养基中，于37 ℃、220 r/min条件下过夜培养。将种子液按3%的接种量转接到TB培养基中，于37 ℃、220 r/min条件下培养至600为0.6，加入ITPG至终浓度为0.1 mmol/L，在25 ℃、220 r/min条件下培养18 h。

1.5 蛋白质纯化

将重组菌菌液在4 ℃、9 000 r/min下离心15 min收集菌体。用20 mmol/L、pH 7.0的磷酸盐缓冲溶液洗涤菌体2次并重悬菌体，冰浴超声破碎。将破碎后的菌液于4 ℃、9 000 r/min条件下离心20 min并收集上清液。纯化时先用缓冲液A(含250 mmol/L NaCl，20 mmol/L咪唑的20 mmol/L、pH 7.4的磷酸盐缓冲液) 平衡镍柱，洗脱用缓冲液B (含250 mmol/L NaCl，500 mmol/L咪唑的20 mmol/L、pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液) 进行梯度洗脱，收集有酶活的洗脱组分进行脱盐处理。

1.6 酶活测定

氨基甲酸乙酯水解酶活性的测定方法采用测定产物氨的生成来计算。取1 mL酶液 (对照为超纯水) 加入1 mL 3%的EC溶液，于37 ℃恒温水浴箱中反应15 min后，加入1 mL 10%三氯乙酸终止反应。反应终止后加入1 mL显色剂I (15 g苯酚和0.625 g亚硝基铁氰化钠定容至 250 mL) 和1 mL显色剂II (13.125 g NaOH和 7.5 mL次氯酸钠定容至250 mL)，混匀后在37 ℃水浴箱中保温20 min，反应结束后用超纯水定容至10 mL，测定625 nm下的吸光度[20]。酶活定义：常压、37 ℃、pH 7.0条件下，1 min分解EC产生1 μmol氨所需酶量为1个酶活力单位(U)。

1.7 酶学性质测定

1.7.1 最适反应温度的测定

将纯化后的野生UH酶及其突变体在不同温度下 (20−65 ℃，间隔5 ℃) 进行酶促反应，测定其最适反应温度。

1.7.2 半衰期1/2的测定

将纯化后的野生UH酶及其突变体置于40 ℃下保温，每隔一定时间取样测定酶活。由公式lnC=lnC+k，1/2=ln2/k计算出酶的半衰期。其中，C是初始酶活，C是时间为时所对应的酶活。

1.7.3 pH对酶活性的影响

将纯化后的野生UH酶及其突变体在不同的pH 4.5−7.0条件下进行酶促反应，测定不同pH值下的酶活。

1.7.4 乙醇对酶活的影响

将纯化后的野生UH酶及其突变体分别在浓度为0%、2%、5%、10%和15%的乙醇条件下反应，测定不同乙醇浓度下的酶活。

1.7.5 酶反应动力学参数测定

以5−300 mmol/L氨基甲酸乙酯为底物，分别测定在相应浓度条件下酶的反应速率。根据底物浓度与反应速度之间的关系，使用GraphPad Prism软件计算动力学常数m与max的值。

2 结果与分析

2.1 基于计算机辅助设计突变位点

为了提高氨基甲酸乙酯水解酶在应用条件下的耐受性，以赖氨酸芽孢杆菌SC02来源的UH酶为研究对象，通过蛋白质分子同源建模和稳定性分析，寻找与酶分子不稳定性相关的结构或区域。通过FlexServ软件对UH蛋白每个氨基酸的B-factor值 (或B值) 进行分析可知，序列中Gln328位B-factor响应值最高，Gln357的B-factor也较高，说明该部分结构不稳定，紊乱度较大 (图1)。

图1 组成氨基甲酸乙酯水解酶各氨基酸的B值

采用分子动力学软件Gromacs对组成UH蛋白中各氨基酸RMSF值进行预测，结果表明最不稳定的区域在328位氨基酸附近(图2)。

图2 组成氨基甲酸乙酯水解酶各氨基酸的RMSF值

借助Discovery Studio程序对UH建模并呈现其3D结构 (图3)。图中红色为RMSF值最高的6个氨基酸：Ser325、Asp326、Leu327、Gln328、Lys329、Arg330。其中RMSF最高的点为Gln328，说明这一区域结果最不稳定，这与B-factor分析结果一致。

图3 UH蛋白三维结构图

通过PoPMuSiC软件分析可知，328Gln及402Asp的DDG分别为–2.30和–6.56，均为负值。说明这2个区域为蛋白质潜在的不稳定区域。

基于以上结果，可以得出Q328位点区域不稳定，因此对328位点进行饱和突变。

2.2 UH突变体的异源表达及酶的分离纯化

以重组质粒pET20b-UH为模板，通过全质粒PCR扩增获得了UH在328位的19个全部突变体。通过测定UH突变体活性，发现只有Q328C、Q328V、Q328R和Q328H 4个突变株有活性。对这4个有活性的突变体分别进行诱导表达和纯化，获得了较纯的UH突变体的纯酶 (图4)。

图4 UH和其突变体蛋白质纯化

2.3 突变体与野生酶酶学性质的比较

2.3.1 温度对野生酶和突变体酶活性的影响

由图4可知，野生酶和突变体的最适反应温度均为30 ℃，但突变体Q328C、Q328R、Q328V在30 ℃以上比野生酶的稳定性好。在37 ℃保温1 h后，Q328C、Q328R、Q328V和UH的残留酶活分别为76.9%、60.8%、75.8%和51.9%，分别比原酶提高了24.0%、8.9%和23.9%。在40 ℃，上述突变体的残留酶活分别提高了31.7 %、19.7%和28.9%。突变体Q328V和其他酶相比，具有更宽的温度稳定范围。

2.3.2 野生酶和突变体半衰期的比较

本研究考察了40 ℃条件下UH及其突变体的半衰期。结果表明，突变体Q328C、Q328V和Q328R的半衰期都比UH长 (表2)。其中Q328C的半衰期最长，达到27.40 min，是UH的7.46倍。

表2 UH酶及其突变体在40 ℃的半衰期

2.3.3 pH对野生酶和突变体酶活性的影响

由图5可知，UH突变体Q328C和Q328R在pH 6.0及以下较野生酶的稳定性有所提高。其中，Q328R较野生酶在低pH下的相对酶活提高幅度较小；而Q328C在酸性条件下酶活的提高幅度较为明显：在pH 6.0条件下相对酶活提高了11%，在pH 4.5条件下，相对酶活也提高了11%。由此可见，突变体Q328C在酸性条件下较野生酶的稳定性有所提高。

图5 温度对野生酶和突变酶活性的影响

图6 pH对野生酶及其突变体酶活性的影响

2.3.4 乙醇对野生酶和突变体酶活性的影响

乙醇对野生酶和突变体酶活性的影响如图7所示，突变酶Q328C在不同乙醇浓度下耐受性均较UH有所提高，尤其在低乙醇浓度下效果更为明显。在2%的乙醇条件下，突变酶Q328C的残留酶活为70.2%，比野生酶提高了25%。在5%乙醇条件下，Q328C的残留酶活为40.2%，比野生酶提高了13%。其他突变体和野生酶相比，对乙醇的耐受性变化不大。

图7 乙醇对野生酶及其突变体酶活性的影响

2.3.5 酶反应动力学参数测定

用GraphPad Prism软件测定野生酶和突变体的动力学常数m及max值，结果如表3所示。

表3 野生酶和突变酶的动力学常数

通过定点突变，突变体Q328V的m值有所降低，说明与底物结合能力增强。同时，Q328C、Q328R、Q328V最大反应速率增大。

3 讨论

RMSF值在分子动力学中是评价一个系统灵活性大小的关键参数，其计算原子在分子动力学轨迹中的迁移率，反映了氨基酸的构象稳定性情况。B值反映了蛋白质分子在晶体中的构象状态，一般B值越高说明紊乱度越大，相应位置的构象就越不稳定或柔性越强。本研究采用基于计算机辅助设计定点突变的方法，预测了组成UH酶的各个氨基酸的B值和RMSF值。动力学模拟表明Q328位点的B值和RMSF值最高，说明该点最不稳定。

通过软件模拟各突变体的RMSF值如图8所示，各突变体的B值如图9所示。Q328C、Q328V、Q328R和Q328H的RMSF值分别由原来的0.618变为0.417、0.582、0.605和0.668；B值分别由原来的1 530变为1 090、1 480、1 510和1 600。对比各突变体328位点的RMSF值和B值，可见突变体Q328C的RMSF值和B值变低，Q328H的RMSF值和B值升高，Q328V的RMSF值和B值降低幅度较小，Q328R的RMSF值和B值基本不变。说明突变体Q328C的构象稳定性增强，Q328H的稳定性降低，Q328V稳定性有较小幅度增强，而Q328R的稳定性基本不变，与实验结果一致。同时该位点位于loop环上，该区域仍有较高的RMSF值和B值。通过动力学分析蛋白分子中各原子的RMSF值和B值对预测突变位点有较好的指导作用。

图8 突变体各氨基酸的RMSF值

图9 突变体各氨基酸的B值

蛋白质分子内作用力的种类和数量对酶分子热稳定性和催化活性产生重要影响[21]。本研究通过DS软件模拟发现，UH野生酶328Gln与324His和325Ser之间各有一个氢键 (Hydrogen bond interaction，图10A)。将这一位点突变为Cys后，增加了2个疏水相互作用力：328Cys-403Leu的苯基作用 (Alkey interaction，图10B) 和328Cys-324His的磷-苯基相互作用 (Pi-alkey interaction，图10B)。有报道指出，增强蛋白内部的疏水作用有助于蛋白整体稳定性的提高[22]，本研究中UH突变体Q328C热稳定的提高与这一结论一致。

图10 Q328C的局部立体图

本文建模时参考的模板为Glutamyl-tRNA (Gln) amidotransferase subunit A (PDB ID：2G5H)，与目的蛋白仅有37.58%的同源性，较低的同源性可能会带来对所建模型的评价误差，仅可作为参考。但该模板在所有模板中覆盖率最高，gap较少，综合评分最高，因此作为选择依据。

本研究首次对编码氨基甲酸乙酯水解酶的基因序列进行了分子改造，通过定点突变提高了酶的稳定性，为深入研究UH酶的蛋白结构与功能提供有利的参考数据，为促进UH酶在降解发酵类食品中的应用提供技术手段。

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(本文责编 陈宏宇)

Stability enhancement of urethanase fromby site-directed mutagenesis

Xiaohui Liu1,2, Fang Fang1,2, Xiaole Xia1, Guocheng Du2,3,4, and Jian Chen1,3,4

1 Key Laboratory of Industrial Biotechnology, Ministry of Education, School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi 214122, Jiangsu, China 2 Synergetic Innovation Center of Food Safety and Nutrition, Jiangnan University, Wuxi 214122, Jiangsu, China 3 Key Laboratory of Carbohydrate Chemistry and Biotechnology, Ministry of Education, Jiangnan University, Wuxi 214122, Jiangsu, China 4 National Engineering Laboratory for Cereal Fermentation Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, Jiangsu, China

Ethyl carbamate as a potential carcinogen commonly exists in traditional fermented foods and beverages. Enzymatic removal of ethyl carbamate from fermented foods and beverages is an efficient and safe method. In this study, we mutated urethanase fromSC02 on the Q328 site through computer aided design approaches. The half-life of resulting mutants Q328C and Q328V was detected to be 7.46 and 1.96 folds higher than that of the original enzyme, and Q328R presented better thermal-tolerance than the original urethanase when incubated at high temperature. The tolerance of Q328C to ethanol and acid also increased when compared with that of the original enzyme. The stability and tolerance to acid and ethanol of urethanase could be improved by modification on its Q328 site.

site-directed mutagenesis, urethanase, ethyl carbamate, enzyme stability

December 11, 2015; Accepted: March 2, 2016

Fang Fang. Tel: +86-510-85918307; Fax: +86-510-85918039; E-mail: ffang@jiangnan.edu.cn

Supported by:Major State Basic Research Development Program of China (973 Program) (No. 2012CB720802), National Natural Science Foundation of China (No. 31371821).

国家重点基础研究发展计划(973计划) (No. 2012CB720802)，国家自然科学基金 (No. 31371821) 资助。

刘晓慧, 方芳, 夏小乐, 等. 定点突变改造提高纺锤形赖氨酸芽孢杆菌氨基甲酸乙酯水解酶稳定性. 生物工程学报, 2016, 32(9): 1233–1242.

Liu XH, Fang F, Xia XL, et al. Stability enhancement of urethanase fromby site-directed mutagenesis. Chin J Biotech, 2016, 32(9): 1233–1242.