印防己毒素在不同类型突触分泌中的作用

阳小飞，梅　颖，余　意，陈恒玲

(中南民族大学 生物医学工程学院，脑认知国家民委重点实验室，医学信息分析及肿瘤诊疗湖北省重点实验室，武汉 430074 )



印防己毒素在不同类型突触分泌中的作用

阳小飞，梅颖，余意，陈恒玲*

(中南民族大学 生物医学工程学院，脑认知国家民委重点实验室，医学信息分析及肿瘤诊疗湖北省重点实验室，武汉 430074 )

为探讨印防己毒素(PTX)阻断抑制性自发和诱发的神经递质释放浓度是否存在差异，以及这些差异是否具有脑区特异性，采用鼠脑皮层神经细胞和海马神经细胞作为实验材料，在外液中加入不同浓度的PTX，分别记录了mIPSC的频率和eIPSC的幅值.结果发现：PTX作用于自发性神经递质释放的半抑制浓度(IC50)显著小于诱发性神经递质释放的，说明自发神经递质释放对于PTX的作用更为敏感.但是皮层细胞和海马细胞之间各项参数的差异较小，说明PTX在各脑区中的作用浓度相似.因此，PTX阻断抑制性神经递质自发释放和诱发释放可能有不同的机制，但并不具有脑区特异性.

印防己毒素；神经递质释放；皮层细胞；海马细胞

神经递质自发释放的现象普遍存在于神经网络中.单个突触囊泡的融合释放不同的神经递质可以使突触后的受体与神经递质结合从而产生自微小型抑制性突触后电流(mIPSC)或者微小型兴奋性突触后电流(mEPSC).神经递质的诱发释放则是由大量的囊泡释放引起的[1-3].已有研究显示，在突触结构中，自发和诱发的神经递质释放产生于不同的机制，自发和诱发的神经传递由突触单独的神经信号传导通路完成[2-5]，然而，最近也有一些文章质疑该观点[6-8]，这个问题目前尚无定论.因此，本文就自发和诱发的神经递质释放是否存在差异展开了研究.

印防己毒素(PTX)在藤蔓植物印度防己的果实中被发现，早于18世纪末已有大量研究表明，PTX在GABAA受体的调控作用中扮演着拮抗剂的角色[9-12].实验中常用PTX阻断GABA电流.为了研究PTX对自发和诱发的神经递质释放的作用是否存在差异，实验通过将不同浓度的PTX分别作用于皮层细胞和海马细胞，记录自发和诱发的神经递质释放所产生的突触后电流，探究PTX对神经细胞自发和诱发的释放的影响.

1　材料与方法

1.1材料

胎牛血清、基本培养基、0.25%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸、转铁蛋白、B-27添加剂，上述生化试剂均来自Gibco公司；胰岛素、葡萄糖、4-羟乙基哌嗪乙磺酸 (HEPES)、阿糖胞苷、乙二醇双四乙酸(EGTA)、多聚赖氨酸、平衡盐溶液(Hanks)、Na2ATP、Na2GTP、NaHCO3、CsCl、NaCl、KCl、CaCl2、MgCl2，以上生化试剂均来自Sigma公司；印防己毒素(PTX)、6-氰基-7-硝基喹喔啉-2,3-二酮 (CNQX )、利多卡因 N-乙基溴(QX-314)，该药品均来自Tocris公司；河豚毒素(TTX) 来自Affix Scientific公司.

1.2仪器

全套自动膜片钳放大器系统(HEKA)；相差显微镜(Olympus)；超净工作台(苏州净化)；二氧化碳恒温细胞培养箱(Thermo Fisher)；蠕动泵(保定兰格恒流泵有限公司)；P-97微电极拉制仪(普升科技有限公司).

1.3方法

1.3.1实验溶液配制

用2% B-27，0.5% w/v葡萄糖，100 mg/L转铁蛋白，5%胎牛血清和2 μM阿糖胞苷来配制实验所需的细胞培养基；电极外液含有140 mM NaCl，5 mM KCl，2 mM MgCl2，2 mM CaCl2，10 mM HEPES和10 mM葡萄糖；电极内液含有120 mM CsCl，5 mM NaCl，1 mM MgCl2，10 mM HEPES，10 mM EGTA，0.3 mM Na-GTP，3 mM Na-ATP；0.5 mM Hanks，0.283 mM HEPES，0.35 mM NaHCO3配制HBS缓冲液.

1.3.2鼠脑皮层神经细胞和海马神经细胞的获取

取新生(P0)野生型小鼠，在显微镜下手术分离鼠脑皮层区和海马区，用胰蛋白酶在37℃消化20 min.将消化后的皮层细胞和海马细胞吹散后滴种于事先用多聚赖氨酸处理过的玻片上，再用细胞培养基培养13～16 d后进行记录.

1.3.3电生理记录

设定PTX浓度梯度以验证其功能和作用机制.海马神经元和大脑皮层神经元体外培养成熟后，使用双极胞外刺激电极进行全细胞膜片钳记录.记录时采用全细胞电压钳模式，并将细胞钳制于-70 mV.使用硼硅酸盐玻璃管拉制电极，标准内外液中电阻约为3～5 MΩ.记录微小型抑制性突触后电流(mIPSC)时在外液中除使用20 mM AMPA-受体阻断剂CNQX和50 mM NMDA受体阻断剂APV阻断其他电流外，再加1 mM TTX来阻断钠离子通道，抑制动作电位发放.实验中先记录一段正常的mIPSC，再在外液中分别加入1 mM、5 mM、10 mM、20 mM、50 mM、100 mM GABA受体阻断剂PTX.记录动作电位触发的抑制性突触后电流(eIPSC)时在外液中使用20 mM CNQX和50 mM APV，内液体中加入5 mM QX-314阻断钠离子通道，抑制被记录细胞发放动作电位，实验方法同上所述.

1.3.4数据处理

用HEKA EPC10记录电流，所得数据用软件Pclamp 10.2(Molecular Devices，Inc)分析；再利用Igor Pro Folder(Wave Metrics，Inc)拟合，得到半抑制浓度(IC50)；最后利用GraphPad Prism 5.01(GraphPad Software，Inc)软件进行统计学分析，并进行t检验.

2　结果

2.1PTX对神经细胞抑制性神经递质释放的阻断作用

首先验证在鼠脑神经细胞中PTX的有效工作浓度.取新生野生型小鼠鼠脑进行培养，13～16 d后开始记录，重复3次独立实验，并对结果进行统计学分析.在含有CNQX、APV和TTX的外液中分别加入0 μM、100 μM PTX，在同一个细胞中记录不同浓度PTX作用下mIPSC的频率.实验结果如图1所示，100 μM的PTX能将抑制性自发神经递质释放几乎完全阻断.与此相似的是，在外液含有CNQX、APV，内液中含有QX-314的条件下，100 μM的PTX能几乎完全阻断抑制性诱发神经递质释放.图1的结果说明，100 μM的PTX足够阻断几乎所有的抑制性神经递质释放.

A，PTX浓度分别为0 mM和100 mM时，记录到的mIPSC代表曲线；B，3次独立重复实验，9个细胞的统计数据；C，PTX浓度分别为0 mM和100 mM时，记录到的eIPSC代表曲线；D，3次独立重复实验，9个细胞的统计数据；差异分析：t检验；**是指p<0.01；***是指p<0.001图1　PTX阻断抑制性神经递质释放Fig.1　PTX blocks inhibitory neurotransmitter release

2.2不同浓度PTX对大脑皮层神经细胞不同类型分泌的影响

足够浓度的PTX能有效阻断GABA电流，但PTX阻断自发和诱发释放的效率分别是怎样的仍不清楚.为了定量测定PTX阻断不同类型分泌的效率，选取培养13 d的皮层神经细胞，采用全细胞膜片钳技术来记录细胞突触后电流，重复进行3次独立实验,并进行了统计学分析，结果如图2所示.实验在含有CNQX、APV和TTX外液中，分别加入0 μM、1 μM、5 μM、10 μM、20 μM、50 μM、100 μM PTX，在同一细胞记录到mIPSC的频率随着PTX浓度增加而减少.记录到的7个频率值通过希尔方程拟合得到曲线，并获取该曲线的IC50.同样，在外液中含有CNQX、APV，内液中含有QX-314条件下，分别加入0 μM、1 μM、5 μM、10 μM、20 μM、50 μM、100 μM PTX，记录到eIPSC的幅值随着PTX浓度升高而降低.将记录到各PTX浓度下eIPSC幅值通过拟合，得到IC50.

将mIPSC组和eIPSC组的IC50进行统计并作t检验，发现eIPSC组的IC50显著高于mIPSC组，而IC50是衡量药物作用效果的一种方式，可以反映某药物在抑制某些生物活动时所需一半的量，PTX作用于抑制诱发神经信号释放所需的半抑制浓度明显高于抑制自发神经信号释放所需的半抑制浓度，也就是说自发神经信号释放机制对PTX的作用更为敏感.

同时在实验中还发现，如果用很多文献中报道的50 μM的PTX，确实能阻断大部分的GABA电流，但仍有10%左右的残余，而100 μM的PTX的阻断效率接近100%.因此对于鼠脑神经细胞，100 μM的PTX应该是更可靠的工作浓度.

A，在PTX浓度分别为0 μM、1 μM、5 μM、10 μM、20 μM、50 μM、100 μM时，记录鼠脑皮层细胞mIPSC代表曲线；B，A中记录到各条件数据的绝对值(左)和归一化的值(右)用希尔方程拟合后曲线；C，在PTX浓度为0 μM、1 μM、5 μM、10 μM、20 μM、50 μM、100 μM时，记录鼠脑皮层细胞eIPSC代表曲线；D，C中记录到各条件数据的绝对值(左)和归一化的值(右)用希尔方程拟合后曲线；E，3次独立重复实验，各细胞mIPSC组和eIPSC组IC50的统计，其中mIPSC组12个细胞，eIPSC组8个细胞；F，每批独立实验，mIPSC组和eIPSC组IC50均值的比较；差异分析：t检验；**是指p<0.01图2　不同浓度PTX阻断大脑皮层神经细胞自发和诱发分泌的效率Fig.2　Different concentrations of PTX blocks the efficiency of spontaneous and evoked neurotransmitter release in cortical neurons

2.3不同浓度PTX对海马神经细胞不同类型分泌的影响

由前面的实验结果得知在鼠脑皮层细胞中自发神经递质释放对PTX作用更为敏感，那这一作用的差异是皮层细胞特有的还是对中枢神经系统的细胞具有普遍性？为了回答这一问题，选用鼠脑海马脑区神经细胞重复了上述实验.

选取13 d的海马细胞进行电生理实验，重复进行3次独立实验，并进行了统计学分析，结果如图3所示，记录到海马细胞的mIPSC的频率和eIPSC的幅值均随着PTX浓度升高而降低.与之前结果相似，PTX对海马细胞中两个不同释放机制的影响是不同的.结果如图3 E，F所示，eIPSC组的IC50显著高于mIPSC组的IC50.同时，将每批独立重复实验的记录结果求均值，再计算其IC50，每批独立实验eIPSC组的IC50都高于mIPSC组.所以无论是海马细胞还是皮层细胞，PTX对于诱发的释放机制和自发的释放机制的作用效果是不同的.

A，在PTX浓度为0 μM、1 μM、5 μM、10 μM、20 μM、50 μM、100 μM时，记录鼠脑海马细胞mIPSC代表曲线；B，A中记录到各条件数据的绝对值(左)和归一化的值(右)用希尔方程拟合后曲线；C，在PTX浓度为0 μM、1 μM、5 μM、10 μM、20 μM、50 μM、100 μM时，记录鼠脑海马细胞eIPSC代表曲线；D，C中记录到各条件数据的绝对值(左)和归一化的值(右)用希尔方程拟合后曲线；E，3次独立重复实验，各细胞mIPSC组和eIPSC组IC50的统计，其中mIPSC组13个细胞，eIPSC组8个细胞；F，每批独立实验，mIPSC组和eIPSC组IC50均值的比较；差异分析：t检验；*是指p<0.05图3　不同浓度PTX阻断海马神经细胞自发和诱发分泌的效率Fig.3　Different concentrations of PTX blocks the efficiency of spontaneous and evoked neurotransmitter release in hippocampal neurons

为了直观地比较皮层细胞和海马细胞之间的异同，分别将皮层细胞和海马细胞mIPSC组和eIPSC组所有独立实验的记录结果求均值，其中皮层细胞mIPSC组12个细胞，eIPSC组8个细胞，海马细胞mIPSC组13个细胞，eIPSC组8个细胞，再计算其IC50，将所得IC50列成表格.结果如表1所示，皮层细胞和海马细胞相比较而言，mIPSC组之间的IC50并无明显差异，eIPSC组之间的IC50亦然.

表1鼠脑皮层细胞和海马细胞mIPSC组和eIPSC组IC50的比较

Tab.1The comparison of IC50 of mIPSC and that of eIPSC in cortical and hippocampal neurons

细胞mIPSCeIPSC皮层细胞26.31523±5.1315340.90578±5.64318海马细胞23.50922±4.3049338.00903±10.24314

因此，PTX对于皮层细胞和海马细胞的作用效果是相似的，也就是说PTX对不同类型突触分泌的作用是具有普遍性的.

3　讨论

在神经细胞的活动中，突触前的Ca2+浓度升高会引发神经递质的释放，神经递质与突触后受体结合，引起突触后电流.根据突触分泌是否需要动作电位触发，可以分作自发释放和诱发释放.

自发和诱发的释放在同一药物的作用下可能出现不同的反应，所以其发放机制可能不同.例如，缺失GluR2的老鼠培养海马神经元，外液中加入蜂毒毒素，5 min内，由AMPA受体调控的自发的mEPSCs(AMPA-mEPSCs)下降到初始水平的20%.相反，加入相同的蜂毒毒素，由AMPA受体调控的诱发的EPSCs(AMPA-eEPSC)仅下降到初始的80%，灌流蜂毒毒素长达10 min，AMPA-eEPSC的幅值仅下降到初始水平的60%.该结果显示，自发和诱发的神经传递激活不同的AMPA受体；突触结构中，自发和诱发的信号可能是独立存在的[1].

另外，一些自发的神经递质释放的调节是通过特定的信号通路来完成的，并且在某些情况下，这些通路的活动可以使自发释放和诱导释放的方向相反[2].与NO相近的某些物质可以抑制动作电位诱发的神经信号释放，但同时增强了自发的信号释放[13]；神经元中胆固醇的消耗或者抑制胆固醇的合成，都会引起自发的神经信号传递的频率增加，但同时削弱动作电位诱发的神经信号传递的频率[14].此外，果蝇突触前大量存在的Brp蛋白，可以促进诱发释放的同时抑制自发的神经信号释放[4]；慢性电刺激可以稳定地减小自发的电生理活动，却反常地增强诱发的神经网络的电活动[5].

近代研究显示：某些神经信号通路可以特定地调节自发神经信号的释放.这种释放模式可以有选择性地调节神经信号传递，但有一定的前提是自发和诱发的神经传递由单独的突触神经信号传导通路完成[2].

越来越多的研究者发现影响自发和诱发释放的调控途径是不同的[2,3]，引起该现象的机制可能是怎样的呢？

突触囊泡库的多样性引起了自发和诱发的神经递质释放[1-3]，然而突触囊泡的可回收库不能同时维持自发和诱发神经递质的释放，储蓄库亦然[15,16].融合机制和囊泡的整体特性的不同导致了两种不同形式的释放[2].

自发和诱发神经递质释放的不同机制在PTX阻断抑制性突触后电流实验中是否体现出差异是本实验关心的问题.我们选取大脑皮层神经细胞和海马神经细胞中的突触分泌来进行比较.通过实验发现PTX对于自发和诱发两种类型突触分泌中不同释放机制的影响是有显著差异的.图2 E和图3 E的结果可以看出，eIPSC组的IC50远大于 mIPSC组的IC50，即阻断mIPSC需要更低浓度的PTX.但是大脑皮层神经细胞和海马神经细胞mIPSC组之间IC50差异较小；eIPSC组的IC50的差异也较小，说明PTX对两个脑区的突触分泌的作用效果是相同的.我们的实验结论进一步揭示了神经信号自发释放和诱导释放可能有不一样的工作机制.

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The Role of Picrotoxin in the Different Types of Synapses Secretion

YangXiaofei,MeiYing,YuYi,ChenHengling

(Key Laboratory of Cognitive Science, key laboratory of Medical information analysis and tumor diagnosis and treatment, Laboratory of Membrane Ion Channels and Medicine, College of Biomedical Engineering, South-Central University for Nationalities, Wuhan 430074, China)

To investigate if there did exist the differential regulation between inhibitory spontaneous and evoked neurotransmitter release blocked by different concentration of picrotoxin (PTX) and to explore whether the difference had the brain regions specificity, neuronal cultures were obtained from mouse cortex and hippocampus, respectively. We monitored spontaneous mIPSCs and eIPSC in different extracellular concentration of PTX, respectively, and observed that the half maximal inhibitory concentration (IC50) of the mIPSCs was significantly smaller than that of the eIPSC, indicating that the spontaneous release was more sensitive when PTX applied. But no obvious difference between cortical and hippocampal cells was revealed in our experiments. Therefore, our results suggested that PTX had differential regulating mechanisms between inhibitory spontaneous and evoked neurotransmitter release, but without brain regions specificity.

picrotoxin; neurotransmitter release; cortex; hippocampus

2016-04-10*通讯作者陈恒玲，研究方向：神经信号转导，E-mmail：chenh@mail.scuec.edu.cn

阳小飞(1979-)，男，教授，博士，研究方向：神经信号转导，E-mail: sunlittlefly@hotmail.com

国家自然科学基金资助项目(31300892)；湖北省自然科学基金资助项目(2014CFA027,2014CFB455)；校科学基金引进人才科研启动基金自科项目(ZZ13002)

R322.85

A

1672-4321(2016)03-0080-05