生命科学前沿技术在病证结合研究中的应用

李晓燕　魏滨　朱美冬

摘要：病证结合研究是目前中西医结合研究的主要思路与方法。病证结合体现了中西医2种医学的优势互补，通过多学科交叉探讨病证之间的关系，研究疾病证候诊断及辨证施治规律等。得益于现代生命科学技术的发展，病证结合研究取得了长足的进步。本文主要介绍了近年来数据挖掘技术、系统生物学技术、表观遗传学技术、网络生物学技术在病证结合研究中的应用和发展前景，为进一步研究和临床应用提供思路和方法。

关键词：病证结合；中西医结合；技术应用；综述

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.10.033

中图分类号：R2-05 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2016）10-0132-05

Abstract： Research on disease-syndrome combination is the main approach and method of research on integrative traditional Chinese and Western medicine. Disease-syndrome combination embodies the complementary advantages of traditional Chinese medicine and Western medicine. It discusses the relationship between diseases and syndromes through an interdisciplinary approach， and explores rules of disease diagnosis and treatment based on differential diagnosis. Thanks to the development of modern life science techniques， research on disease-syndrome combination has made great achievements. This article mainly introduced the application and the development prospects of new techniques， such as data mining， system biology， epigenetics， biological network and network pharmacology in the research on disease-syndrome combination in recent years， with a purpose to provide the ideas and the methods for further research and clinical application.

Key words： disease-syndrome combination； integrative traditional Chinese and Western medicine； technique application； review

中医的“证”是对机体在疾病发展中某一阶段的病理概括，而西医所诊断的“病”是指人体在受到致病因素作用后，在体内出现的具有一定发展规律的病理演变全过程，二者相互交叉，同一疾病在不同发展阶段会出现不同证候，同一证候又会出现在不同疾病中。病证结合研究是把中医的证放在疾病背景下研究，是多种理论的相结合及囊括多种诊疗措施的现代病证结合的新模式，对提高临床诊疗水平具有重要意义。

病证结合研究的关键任务是解决证候分类的客观化、证候的分子生物学基础及证候的发生演变的内在机制等问题。近年来病证结合研究取得较大进展，这与生命科学技术及分析技术的发展是同步的。这些新技术主要包括数据挖掘技术、系统生物学技术、表观遗传学技术及生物网络技术等。兹就相关技术在病证结合研究领域的应用作一综述。

1 数据挖掘技术

数据挖掘是利用统计分析和人工智能等新技术以分析数据库中的数据，寻找其规律性，提取出事先未知而潜在有用的信息。其代表方法有多元统计、聚类分析、关联分析、决策树、神经网络、贝叶斯网络和潜在结构模型等。因传统中医证候诊断主观性强，病证原始数据的获得过程中可能混杂不规范数据或噪声数据，导致众多临床资料中隐藏着大量的信息[1]，其辨证过程也缺乏客观的衡量依据，不能为科学实验提供客观诊断[2]。数据挖掘技术以其善于处理非线性复杂数据、挖掘数据内在规律而在中医证候研究中受到广泛的关注，在中医证候模型的建立方面具有一定的优势[3]。

有研究者运用数据包络分析法对中医证候进行“序列化”，抛弃以往对证候数据的无序挖掘，利用证候的发生、演变、转归等规律进行建模[4]。隐结构模型可通过客观资料的分析，揭示证候发生与共生的规则，获得复杂分类标准。而在具有先验知识的前提下，贝叶斯网络进行证候分类的正确率较高。关联规则算法在对数据进行分析，从中找到证候元素对证型判别的贡献权重，形成“证候元素-证型”诊断量表[5-7]。而且，中医“病证结合”的研究应重视以“证”为研究单位，引进微观辨证的研究成果，综合运用不同的智能算法进行数据挖掘，才能达到最佳的证候诊断效果。

2 系统生物学技术

系统生物学是以系统理论为指导，研究一个生物系统中所有组成成分（基因、蛋白质等）的构成，以及在特定条件下这些组分间相互关系的科学。系统生物学的“涌现”特性与中医的整体观异曲同工，利用组学技术检测机体的生物学物质基础，进而整合这些生物信息，进而探索和阐明机体物质组学的整体变化，这为病证结合研究提供了新的研究思路[8]。系统生物学技术主要包括基因组学技术、转录组学技术、蛋白质组学技术以及代谢组学技术等，将这些组学技术运用到病证结合研究中，得到病证相关指纹图谱，获取证候相关生物标志物，极大地推进了病证结合研究的进展。

2.1 基因组学/转录组学技术

基因组学技术主要是对生物体内所有基因进行绘图、核苷酸序列分析及基因功能分析，研究基因组的表达、基因的多样性、基因组功能的阐释及蛋白质产物的功能等的技术。包括基因芯片、测序等各种高通量技术以及实时荧光PCR等定量分析技术。转录组学是功能基因组学的重要组成部分，是在整体水平上研究基因全部转录本种类、结构和功能及转录调控规律的学科。

证候作为机体对致病因素的反应，不仅与致病因素的性质和强弱有关，更与患者个体的体质因素有关，而基因组学认为基因序列的多态性及基因表达的差异又决定了个体差异，可以认为基因及其表达的改变是证的“内涵”。所以，运用基因芯片、测序等技术以发现不同证候基因序列的多态性及表达谱之间的差异，从而确定证候相关基因，有助于证候精确诊断[9]。迄今的研究显示病证的基因组学研究主要包含2个层次，即证候的单核苷酸多态性研究和证候的基因表达谱研究。

2.1.1 证候基因多态性研究 二代测序或大规模并行测序的出现，将各种分析和筛选轻松升级。技术革新使测序数据的数量和质量不断攀升。运用基因测序技术，检测不同证候患者基因序列，通过比较得出疾病相关基因多态性与证候之间的联系，有利于中医证候分型研究[10]。Zhou等[11]利用Affymetrix SNP芯片对12个肾阳虚及3个非肾阳虚患者进行单核甘酸多态性检测，发现肾阳虚证有5处（包括DCDC5基因）发生连锁失衡单核苷酸多态性变化，并证实DCDC5基因及其旁边其他基因单核甘酸多态性与肾阳虚证有关。Li等[12]利用SNaP shot Assay研究扶正化瘀方对乙型肝炎肝硬化患者CYP1A2基因多态性的影响，结果表明扶正化瘀方对乙肝肝硬化证候组的作用与CYP1A2-G2964A位点基因多态性有关。

目前三代测序技术（即单分子测序技术）逐渐发展起来，与二代测序技术相比，单分子测序技术具有更加快速、简便、读长更长、分辨率也更高的特点，且单分子测序技术可直接对RNA进行测序，即检测细胞和组织内基因表达水平，同时对基因的结构做出分析，这会大大促进对病证基因表达谱的研究。另外，三代测序技术可检测出基因的甲基化，为病证的表观遗传调控的研究打开了一条通路[13]。

2.1.2 证候的基因表达谱研究 基因表达谱芯片是基因芯片中的一个重要分支，主要侧重于研究转录水平上基因的变化，用于阐明在疾病、药物或其他因素的干扰下，基因的表达差异情况。利用基因表达谱芯片技术，研究者可对不同状态的组织细胞内基因表达情况进行对比分析，进一步阐明基因的相互协同、抑制、互为因果等关系，并能通过分析比较这些差异表达基因，进而逐步识别决定证本质的关键基因，在基因表达的基础上阐明证候的发生、演变机制[14]。有研究运用基因表达谱芯片技术检测乙肝和肝硬化患者不同证候的差异基因表达谱，找出差异基因，获得显著成果，从分子层面上为中医“异病同证”“同病异证”的客观化提供依据[15-17]。笔者认为，运用基因表达谱芯片检测病证相关的差异表达基因，能在一定程度上揭示病证生物物质基础及其分子机制。

2.2 蛋白组学技术

蛋白质组学技术是以蛋白质组为研究对象，分析细胞内蛋白质的组成成分、表达水平与修饰状态的动态变化，了解蛋白质之间的相互作用与联系，在整体水平上研究蛋白质组成与调控的活动规律的技术。蛋白质组学动态、宏观、整体和综合特点与中医证候具有的波动性、整体性、时序性、可预测性和标志性极其相似，有利于动态的揭示同一个研究对象不同时期的变动性，更符合病证的特点[18]。常用的蛋白组学技术包括二位凝胶电泳技术、多位液相色谱技术、质谱技术及蛋白芯片技术等。

运用蛋白质组学技术对同病异证或异病同证患者的组织和细胞蛋白质进行分析研究，可揭示疾病发生发展变化过程中蛋白质的差异表达。因此，蛋白质组学技术能够成为揭示中医证候变化以及药物作用靶点物质和功能基础的重要手段，并且在此基础上可以建立疾病证候的蛋白质数据库[19]。

有研究者对子宫内膜异位症（EMT）不同证候患者增生期在位和异位内膜组织和增生期正常子宫内膜组织标本提取组织总蛋白，并通过双向电泳技术辅助激光解吸电离飞行时间质谱及蛋白质数据库检索进行蛋白质鉴定。结果显示EMT不同证候之间蛋白质组成分存在差异。推测这些差异可能是证候实质的内在根源，可能成为EMT不同证候发病的候选生物标志物[20]。Song等[21]运用SELDI蛋白芯片检测慢乙肝虚证和实证患者的血清蛋白，并进行复杂分析，结果发现2种血清蛋白可作为慢乙肝虚证和实证的分类依据。因此，蛋白组学研究可能为病证结合诊断提供生物标志物，辅助临床诊断，能明显提高诊断的准确性，进而提高对证治疗效果。

2.3 代谢组学技术

代谢组学技术是通过考察生物体系受刺激或扰动后（如将某个特异的基因或环境变化后）代谢产物的变化或其随时间的变化，研究生物体系的代谢途径的一种技术。常用的代谢组学技术包括核磁共振技术、气相色谱质谱联用技术、液相色谱质谱联用技术等。基于代谢组学可以观测生物体受到扰动后（外界刺激、环境变化或遗传修饰）所有代谢应答的全貌和动态变化，与中医辨证论治的整体观和动态连续性相契合，代谢组学更有利于动态揭示证候发生演变规律。运用代谢组学技术在病证结合临床研究中有助于早期发现疾病证候生物标志物而达到辅助临床诊断的目的[22-23]。该技术能通过检测不同时间点患者的代谢组，对由疾病及对证治疗引起的代谢产物的动态变化进行分析[24]。

3 表观遗传学技术

表观遗传调控是指不改变基因DNA序列，而通过某种机制改变基因座或染色体状态，并进一步影响表型的调节方式。表观遗传调控是复杂疾病证候本质的重要内容，是遗传与环境共同作用的结果，对同病异证、异病同证进行表观遗传调控研究或许是揭示证候本质的一种途径，表观遗传调控的可逆性也是中医通过综合方式调控的重要环节[25-26]。表观遗传学调控包括DNA甲基化、组蛋白修饰、RNAi、染色体重塑、基因组印迹、microRNA调控等在内的多种修饰机制。刘氏[27]采用甲基化特异性聚合酶链反应检测急性髓系白血病和健康人ID4基因启动子区甲基化状态并进行组间及中医证型间比较，结果显示ID4基因启动子区甲基化阳性表达与证候相关。由于表观遗传是可逆性的，因此，笔者认为消除表观调控对基因的影响是中医调治复杂性疾病证候的重要环节。

microRNA（miR）是一类非编码的单链小分子RNA，通过和靶基因mRNA碱基配对引导沉默复合体降解mRNA或抑制mRNA的翻译，从而在转录后水平调控基因表达。研究表明，miR可通过调控组蛋白修饰引起染色质重塑，导致基因表达异常[28]。Gao等[29]发现，miR-17、miR-21、miR-181b和miR-196a可作为胰腺癌辨证依据。Zhang等[30]发现，血清miR-583和miR-663或许可作为区分乙肝肝胆湿热证和肝肾阴虚证的标志物。虽然尚无miR调控表观遗传的病证结合方面的研究，但笔者认为这将成为揭示环境对证候影响的中医理论分子内涵的重要途经。

4 网络生物学技术

网络生物学技术是利用生物网络（包括基因调控网络、蛋白交互网络、代谢和信号转导网络等）描述研究对象的生物学性质、分析因果关系、认识生命活动规律的一门技术。人是生物分子相互作用形成的复杂网络，病证的发生发展是这个复杂网络失衡导致的，单一分子及其构成的单一信号转导通路难以反映病证机制和治疗的关键，因此需要从整体联系的角度，整合不同层次的信息达到对病证机制的整体理解和认知。而生物分子网络则是该研究策略下的重要切入点[31]。所以，把网络生物学技术运用到病证结合研究中，有助于从分子水平综合描述病证发展过程的复杂性及其相互之间的关联关系，以及寻找辨证选方的中药方剂作用的靶标。

4.1 基于生物分子网络的“病-证”关系研究

生物分子网络主要是指基因、基因产物和代谢物等生物分子之间通过复杂相互作用而形成的网络，也可拓展到以生物分子为基础的信号通路网络、代谢网络、生物过程网络、组织网络等。而融合文献挖掘与基因表达谱分析、构建特定“病-证”生物分子网络是用于分析同病异证、异病同证分子基础的前提条件。研究显示，将分子生物网络运用到病证结合研究，不仅能进一步理解寒热、血瘀等不同证候之间的关系，还可从分子层面对疾病“辨证论治”及药物与疾病之间“同病异治”“异病同治”的研究提供实验依据[32]。Lu等[33]将“病-证”的关系置于生物分子网络的背景下进行比较分析，探讨了慢性乙型肝炎和肝硬化“同病异证”“异病同证”的分子机制。

4.2 基于网络药理学的辨证论治研究

网络药理学是建立在疾病-基因-药物的多层次网络基础上，从整体上预测药物靶点、提高药物发现效率的新兴学科[34]。辨证施治是中医治疗学的精华，也是中医药个性化治疗的主要表现。运用网络药理学方法研究病-证-方对应关系，可以揭示疾病、证候、方药之间的内在联系及网络调控机理，从而更深入把握辨证论治的精髓。有研究通过IPA软件分别构建类风湿关节炎（RA）热证和对证中药靶蛋白的分子相互作用网络，结果显示，RA热证的疾病状态和对证中药的干预靶点，都能作用在相同的细胞信号转导通路，干预通路中的相同或不同的关键分子，进而影响整个通路的生物学功能。这也许就是对证中药治疗RA热证“药-证对应”的分子生物学机制之一。

网络生物学的方法应用于中医证候及中药复方的研究，对科学、合理的解释中医证候特征、证候病机演变内涵及病-证-方的相关性等中医学最根本问题甚有裨益；另外，还可用于观察中药干预前后患者代谢网络的整体变化及动态趋势，分析干预前后生物网络的变化，探明中药复方干预该病证在代谢网络层面上的功能模块和生物靶点，从而提供研究中药复方作用机制的新思路。

5 展望

开展中西医生物医学信息学研究，分析与挖掘病证组学数据，并进行“病-证-方/效”生物网络的构建与分析，从而为临床诊断和治疗提供决策支持，是开展病证结合研究的主要思路。尽管上述新技术为病证结合研究提供了不少支持并取得一定成果，但尚有许多问题有待改进，如数据挖掘仅用于证候诊断量表及诊断模型的建立，且处于探索阶段，并不能真正代替医生诊断。因此，还需在建立完整的四诊数据库基础上开发真正的人工智能诊断系统。另外，利用系统生物学技术获得病证动态变化信息虽然反映了机体内的动态变化，但因没有确切的诊断标准，故这种标志物指向相对的，尚不能实际用于临床诊断。如何确立统一标准，从而为诊断治疗及疗效判定提供一个确切的标准是今后的研究重点。

针对病证结合研究不断积累的大量数据，开展基于系统生物学、生物信息学及复杂科学等多学科交叉的病证分子诊断及其调控机制研究，能为具有整体思维和个体化特征的中医临床证候的精确诊断和治疗提供依据，促进中西医结合学科及中西医结合临床精确医疗的发展，推动中医药大健康发展及个体化精确医疗科学前沿研究。即以个人基因组信息为基础，结合蛋白质组、代谢组及表型组等相关内环境信息，为患者量身设计出最佳诊疗方案，以期达到治疗效果最大化和不良反应最小化的一门定制医疗模式。因此，利用新技术开展中西医病证结合研究将为个体化精确医疗作出巨大贡献。

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（收稿日期：2015-08-10）

（修回日期：2015-10-09；编辑：梅智胜）