对照品法和对照提取物法测定岗松油中α—蒎烯、β—蒎烯、桉油精和芳樟醇含量比较分析

罗轶　白桂昌　陆敏仪

摘要：目的 分别用对照品法和对照提取物法测定岗松油中α-蒎烯、β-蒎烯、桉油精和芳樟醇的含量，探讨选择对照提取物替代单体对照品测定岗松油含量的可行性。方法 采用DB-5气相毛细管色谱柱（60 m×0.25 mm×0.25 ?m）；程序升温：起始温度80 ℃，保持15 min，1 ℃/min升至90 ℃，保持2 min，10 ℃/min升至110 ℃，25 ℃/min升至240 ℃，保持8 min；进样口温度250 ℃；检测器温度250 ℃。结果 α-蒎烯、β-蒎烯、桉油精和芳樟醇在各自的浓度范围内均有良好的线性关系（r≥0.999），平均回收率为96.5%～102.2%；t检验表明2种测定方法得出的含量结果无明显差异。结论 对照提取物法可用于岗松油的质量评价。

关键词：对照品法；对照提取物法；气相色谱法；岗松油；α-蒎烯；β-蒎烯；桉油精；芳樟醇；含量测定

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.10.023

中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2016）10-0100-04

Abstract： Objective To determinate the contents of α-pinene， β-pinene， eucalyptol and linalool in Baeckea frutescens by reference substances method and reference extract method respectively； To explore the feasibility of replacing single component reference by control extracts in assay. Methods The GC system consisted of a quartz column DB-5 （60 m×0.25 mm×0.25 ?m）； The temperature programming rose from 80 ℃ （15 min） to 90 ℃ by 1 ℃/min， lasting 2 min， then 10 ℃/min to 110 ℃， then 25 ℃/min to 240 ℃， lasting 8 min in the end； The temperature of the entrance of capillary vessel column was 250 ℃， and the temperature of the detector was 250 ℃. Results α-pinene， β-pinene， eucalyptol and linalool were in a good linear relationship within each concentration scope （r≥0.999）. The average recovery rates were in the range of 96.5%–102.2%. The results of t-test demonstrated that there is no significant difference between the two methods. Conclusion The reference extract method can be used as a quality evaluation pattern for Baeckea frutescens.

Key words： reference substances method； reference extract method； gas phase chromatography； Baeckea frutescens； α-pinene； β-pinene； eucalyptol； linalool； content determination

多成分含量测定法逐渐成为中药质量控制的趋势。由于中药成分复杂，从药材中提取、分离、制备对照品对分离及制备技术要求很高，从而导致对照品供应困难，也不利于检验成本控制，且部分对照品的稳定性差，难以解决储存和运输等问题。为减少单体中药化学对照品的使用，“一测多评”的含量测定方法在一定程度上解决了中药对照品短缺的问题，现已在多种中药的多成分定量分析和多指标质量控制中得到应用[1-3]，但此方法的实用性和耐用性存在一些问题[4]。开发标定多个单体成分含量的对照提取物是解决中药化学对照品短缺问题的一个好方法[5-6]。

岗松油为桃金娘科植物岗松Baeckea frotescens L.的枝叶经水蒸气蒸馏提取的挥发油，其质量标准收载于广西壮族自治区《壮药质量标准》第一卷，在医药及香精香料等领域具有较广泛的应用。目前该品种的地方标准含量测定项只有桉油精和芳樟醇2个检测指标[7]，难以控制本品的内在质量。本研究建立对照提取物法测定岗松油中α-蒎烯、β-蒎烯、桉油精和芳樟醇的含量测定方法，并与传统的外标对照品法进行比较，以进一步完善岗松油的质量标准。

1 仪器与试药

美国安捷伦公司Agilent 6890N型气相色谱仪，氢火焰离子化检测器（FID）；瑞士METTLER TOLEDO XS205电子天平。α-蒎烯对照品（中国食品药品检定研究院，含量测定用，批号110897-200502），β-蒎烯对照品（Chem Service，批号207500，含量99.5%），桉油精对照品（中国食品药品检定研究院，含量测定用，批号110788-201105），芳樟醇对照品（中国食品药品检定研究院，含量测定用，含量98.5%，批号11503-201302）；岗松油对照提取物（自标，α-蒎烯9.17%，β-蒎烯9.38%，桉油精8.13%，芳樟醇8.13%）；岗松药材经广西壮族自治区食品药品检验所黄清泉药师鉴定，为桃金娘科植物岗松Baeckea frotescens L.带有花果的枝叶；28批岗松油样品由广西源安堂药业有限公司提供；无水乙醇为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：DB-5气相毛细管色谱柱（柱长60 m，内径 0.25 mm，膜厚0.25 ?m）；流速：1.0 mL/min；柱温为程序升温：初始温度80 ℃，保持15 min，以1 ℃/min速率升温至90 ℃，保持2 min，再以10 ℃/min速率升温至110 ℃，25 ℃/min升温至240 ℃，保持8 min；进样口温度250 ℃；检测器温度250 ℃；分流进样，分流比10∶1；进样量1 ?L。色谱图见图1。

2.2 对照提取物的制备

取净选后的岗松枝叶药材，加水10倍量，水蒸气蒸馏2 h，静置，分取油层，封装于安瓿瓶中，即得岗松油对照提取物。

2.3 对照溶液制备

2.3.1 对照品溶液制备 分别精密取α-蒎烯、β-蒎烯、桉油精和芳樟醇对照品适量，精密称定，精密称定，加无水乙醇制成每1 mL含α-蒎烯对照品0.3 mg、β-蒎烯对照品0.3 mg、桉油精对照品0.4 mg、芳樟醇对照品0.4 mg的混合溶液，即得。

2.3.2 对照提取物溶液制备 精密称取岗松油对照提取物0.2 g，置50 mL量瓶中，加无水乙醇溶解稀释至刻度，摇匀，即得。

2.4 供试品溶液制备

精密称取本品0.2 g，置50 mL量瓶中，加无水乙醇溶解稀释至刻度，摇匀，即得。

2.5 线性关系考察

2.5.1 单一对照品标准曲线的制备 精密称取α-蒎烯对照品261.12 mg，置10 mL量瓶中，加无水乙醇使溶解并稀释至刻度，摇匀：精密称取β-蒎烯对照品270.15 mg，置10 mL量瓶中，加无水乙醇使溶解并稀释至刻度，摇匀；精密称取桉油精对照品230.21 mg，置10 mL量瓶中，加无水乙醇使溶解并稀释至刻度，摇匀；精密称取芳樟醇对照品267.08 mg，置10 mL量瓶中，加无水乙醇使溶解并稀释至刻度，摇匀；再精密吸取上述α-蒎烯对照品溶液、β-蒎烯对照品溶液、桉油精对照品溶液及芳樟醇对照品溶液各2 mL，置同一10 mL量瓶中，加无水乙醇稀释至刻度，摇匀，作为混合对照品溶液①。精密吸取混合对照品溶液①2.0 mL，分别置5、10、20 mL量瓶中，加无水乙醇稀释至刻度，摇匀，作为混合对照品溶液②、③、④；精密吸取混合对照品溶液④2.0 mL，分别置5、20、50 mL量瓶中，加无水乙醇稀释至刻度，摇匀，作为混合对照品溶液⑤、⑥、⑦。分别精密吸取混合对照品溶液①～⑦，进样1 μL，测定。以对照品进样量为横坐标，峰面积积分值为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程：α-蒎烯Y=1.725 6×103X+11.151，r=1.000 0；β-蒎烯Y=1.827 2×103X+12.326×10，r=1.000 0；桉油精Y=1.556 9×103X+81.778，r=1.000 0；芳樟醇Y=1.532 8×103X+13.401，r=0.999 9。

2.5.2 对照提取物标准曲线的制备 精密称取岗松油对照提取物10.40、55.35、196.28、507.28、1009.16、2016.10 mg，分别置50 mL量瓶中，加无水乙醇至刻度，摇匀，作为对照提取物系列溶液。分别精密吸取上述对照提取物溶液，进样1 μL，测定。以进样量为横坐标，峰面积积分值为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程：α-蒎烯Y=1.690 1×106X-6.967 0×104，r=0.999 8；β-蒎烯Y=1.795 1×106X-7.223 7×104，r=0.999 8；桉油精Y=1.593 8×106X-6.458 7×104，r=0.999 6；芳樟醇Y=1.597 0×106X-4.646 6×104，r=0.999 8。

2.6 精密度试验

取同一份供试品溶液（批号20131129），连续测定6次，记录α-蒎烯、β-蒎烯、桉油精和芳樟醇的峰面积，结果RSD分别为0.57%、0.60%、0.67%、0.69%，表明仪器的精密度良好。

2.7 稳定性试验

取同一份供试品溶液（批号20131129），分别于0、5、10、16、24、36 h进样，测定α-蒎烯、β-蒎烯、桉油精和芳樟醇的峰面积，结果RSD分别为0.97%、0.77%、0.79%、0.72%，表明供试品溶液在36 h内稳定。

2.8 重复性试验

取同一批样品（20131129）9份（0.1、0.2、0.4 g各3份），按“2.4”项下方法制成供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定。结果α-蒎烯含量为8.243 2%，RSD=2.51%；β-蒎烯含量为7.585 0%，RSD=2.96%；桉油精含量为10.252 6%，RSD=1.30%；芳樟醇含量为7.438 4%，RSD=1.66%。

2.9 加样回收率试验

2.9.1 对照品加样回收率试验 取已知含量的样品（批号20130711，α-蒎烯、β-蒎烯、桉油精和芳樟醇含量分别为9.299 8%、9.345 9%、8.322 6%、8.252 4%）0.1 g，共9份，分别精密加入α-蒎烯、β-蒎烯、桉油精和芳樟醇对照品溶液适量，按“2.4”项下方法操作，并按“2.1”项下色谱条件测定，计算回收率。结果α-蒎烯平均加样回收率为102.22%，RSD=1.98%（n=9）；β-蒎烯平均加样回收率为101.07%，RSD=1.25%（n=9）；桉油精平均加样回收率为101.34%，RSD=2.15%（n=9）；芳樟醇平均加样回收率为101.10%，RSD=2.18%（n=9）。

2.9.2 对照提取物加样回收率试验 取已知含量的样品（批号20131129，α-蒎烯、β-蒎烯、桉油精和芳樟醇的含量分别为8.243 2%、7.585 0%、10.252 6%、7.438 4%）0.1 g，共9份，分别精密加入岗松油对照提取物（批号20130711）50、100、200 mg（各3份），按“2.4”项下方法操作，并按“2.1”项下色谱条件测定，计算回收率。结果α-蒎烯平均加样回收率为97.65%，RSD=2.19%（n=9）；β-蒎烯平均加样回收率为97.20%，RSD=1.66%（n=9）；桉油精平均加样回收率为96.54%，RSD=1.26%（n=9）；芳樟醇平均加样回收率为98.09%，RSD=1.11%（n=9）。

2.10 对照品法和对照提取物法测定结果比较

取样品（批号20131129），按3个梯度0.1、0.2、0.4 g取样，每梯度取样5份，采用对照品法及对照提取物法同时进行测定，经t检验，除芳樟醇外，α-蒎烯和β-蒎烯总量（α-蒎烯和β-蒎烯为同分异构体，可合并计算）、桉油精测定的结果均存在明显差异，但2种方法测定结果RSD值均小于1.0%，表明差异较小，认为采用对照提取物法代替对照品法测定是可行的。

2.11 样品测定

取不同批号样品，按“2.4”项下方法制成供试品溶液，并按“2.1”项下色谱条件测定α-蒎烯、β-蒎烯、桉油精和芳樟醇的含量含量，结果见表2。对测得的数据进行t检验，结果α-蒎烯和β-蒎烯总量、桉油精、芳樟醇测定结果未见明显差异，且2种方法测定结果RSD值均小于4.0%，差异较小，可以采用对照提取物替代对照品进行岗松油的质量控制。

3 讨论

本试验曾用DB-5、WonderCap-5、SPB-5色谱柱进行分离，结果不同品牌色谱柱的耐用性都很好；曾用Agilent6890A、岛津2010-plus气相色谱仪进行分离，结果不同品牌的气相色谱仪耐用性都很好。供试品曾分别用无水乙醇、甲醇、丙酮、乙酸乙酯、三氯甲烷溶解后进样测定，结果得到的色谱图基本一致，使用低毒的无水乙醇直接稀释样品，方法简单可行。

采用已标定各成分含量的对照提取物代替多个化学对照品进行定量，具有简便、运行成本低的优点，应用前景广阔。

参考文献：

[1] 王智民，高慧敏，付雪涛，等.“一测多评”法中药质量评价模式方法学研究[J].中国中药杂志，2006，31（23）：1926.

[2] 王俊俊，张俐，郭青，等.一测多评法测定8个银翘解毒系列制剂中的7种酚酸类成分的含量[J].药学学报，2015，50（4）：485.

[3] 杨东亮，马桂芝，王娟，等.一测多评法测定杜麻颗粒中5种成分的含量[J].西北药学杂志，2015，30（3）：247.

[4] 逄瑜，孙磊，金红宇，等.替代对照品法在中药多指标含量测定中的应用与技术要求探讨[J].药物分析杂志，2013，33（1）：169.

[5] 席骏钻，钱怡云，段金廒，等.对照提取物用于当归药材质量控制的研究[J].中国中药杂志，2014，39（19）：3803.

[6] 薛翠娟，章军，荆文光，等.对照提取物法测定葛根饮片中5种成分含量[J].中国中药杂志，2012，37（16）：2388.

[7] 广西壮族自治区卫生厅.广西中药材标准：第二册[M].南宁：广西科学技术出版社，1996：124.

（收稿日期：2016-04-01）

（修回日期：2016-05-16；编辑：陈静）