四神丸对溃疡性结肠炎模型大鼠结肠组织Toll样受体2、4表达的影响

朱向东　王燕　何兰娟

摘要：目的 观察四神丸对脾肾阳虚型溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）大鼠结肠组织Toll样受体（TLR）-2、TLR-4基因及蛋白表达的影响，探讨其治疗脾肾阳虚型溃疡性结肠炎的作用机制。方法 采用氢化可的松注射液腹腔注射+番泻叶灌胃+三硝基苯磺酸/乙醇灌肠法建立脾肾阳虚型溃疡性结肠炎大鼠模型。将90只Wistar大鼠随机分为空白组、模型组、阳性药组及四神丸高、中、低剂量组，各给药组给予相应药物干预。RT-qPCR检测大鼠结肠组织TLR-2、TLR-4 mRNA表达，Western blot检测大鼠结肠组织TLR-2、TLR-4蛋白表达，并测定血清超氧化物歧化酶（SOD）活性及丙二醛（MDA）含量。结果 与空白组比较，模型组大鼠血清SOD活性明显降低、MDA含量明显升高（P<0.01），结肠组织TLR-2、TLR-4基因及蛋白表达明显增强（P<0.05）；与模型组比较，各给药组大鼠血清SOD活性明显升高、MDA含量明显降低（P<0.05，P<0.01），结肠组织TLR-2、TLR-4基因及蛋白表达明显降低（P<0.05，P<0.01）。结论 四神丸可能通过改善结肠组织氧自由基的代谢，调控肠上皮免疫系统，达到治疗UC的目的。

关键词：溃疡性结肠炎；四神丸；Toll样受体2；Toll样受体4；大鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.10.016

中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2016）10-0067-05

Abstract： Objective To observe the effects of Sishen Pills on gene and protein expressions of toll-like receptor 2 （TLR-2） and toll-like receptor 4 （TLR-4） of colonic tissue in spleen-kidney yang deficiency rats with ulcerative colitis （UC）； To discuss its mechanism of action for spleen-kidney yang deficiency UC. Methods Lavage of senna + intraperitoneal injection of hydrocortisone injection + enema of 2，4，6-trinitrobenzene sulfonic acid/ethanol were used to establish the model of UC of spleen-kidney yang deficiency type. 90 Wister rats were randomly divided into blank group， model group， Salazosulfadimidine group and the Sishen Pills high-， medium- and low-group. Each medication group was intervened by relevant medicine. RT-qPCR was used to detect the expressions of TLR-2 and TLR-4， and Western blot was used to detect the protein expressions of TLR-2 and TLR-4. SOD and MDA in serum were detected. Results Compared with the blank group， SOD activity decreased and MDA content increased in the model group （P<0.01）； gene and protein expressions of TLR-2 and TLR-4 increased significantly （P<0.05）. Compared with model group， SOD increased and MDA content decreased in all the medication groups （P<0.05， P<0.01）； gene and protein expressions of TLR-2 and TLR-4 decreased （P<0.05， P<0.01）. Conclusion Sishen Pills can achieve the treatment of UC by improving the metabolism of oxygen radicals in colonic tissue and regulating the immune system of the intestinal epithelium.

Key words： ulcerative colitis； Sishen Pills； Toll-like receptor 2； Toll-like receptor 4； rats

溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）作为一种炎性肠病的难治病和易发病，近年我国发病率持续上升，但其发病机制尚不明确。目前，多数学者认为免疫功能异常是该病发生的主要机理[1]。四神丸作为治疗脾肾阳虚型UC经典方，临床上广受推崇。前期研究表明，四神丸通过下调核因子（NF）-κB p65、细胞间黏附分子-1（ICAM-1）的含量，进而抑制炎症细胞的释放，达到治疗UC的目的[2-3]。Toll样受体（toll-like receptors，TLR）是参与非特异性免疫的一类重要蛋白质分子，也是连接非特异性免疫和特异性免疫的桥梁[4]。相关研究表明，TLR所介导的信号通路在UC的发病中发挥着重要的作用[5]。本实验旨在通过复制脾肾阳虚型UC大鼠模型，观察四神丸对TLR-2、TLR-4基因及蛋白表达的影响，探讨其治疗脾肾阳虚型UC的作用机制，为该方的临床应用提供实验佐证。

1 实验材料

1.1 动物

SPF级Wistar大鼠90只，雌雄各半，鼠龄50 d，体质量（180±20）g，甘肃中医药大学科研实验中心，动物合格证号SYXK（甘）2011-0001。饲养于甘肃中医药大学科研实验中心SPF级实验室。

1.2 药物

氢化可的松注射液，天津药业焦作有限公司，批号11080411，规格5 mg/mL；柳氮磺砒啶（SASP）肠溶片，海信谊天平药业有限公司，批号120301，规格0.25 g/片，研末后溶于蒸馏水，浓度为0.036 g/mL。番泻叶购于兰州惠仁堂药店，用100 ℃蒸馏水浸泡30 min，过滤去渣，用乙醇浓缩为1 g/mL（即100%浓度），置于4 ℃冰箱保存备用。四神丸（补骨脂、吴茱萸、肉豆蔻、五味子、生姜、大枣，按照4∶2∶2∶1∶2∶2比例称取，饮片购于兰州惠仁堂药店）。按照传统方法熬制，然后将药物用乙醇浓缩法浓缩后置于4 ℃冰箱保存备用。

1.3 试剂

2，4，6-TNBS，Sigma公司，批号2508-19-2；丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）检测试剂盒，南京建成生物工程研究所，批号20150417、20150416；荧光定量PCR试剂盒，Promega Corporation公司，批号0000144569；PCR反转录试剂盒，Promega Corporation公司，批号0000144838；PCR引物由上海生工生物工程有限公司设计；Trizol Reagent，Invitrogen公司，批号90804；BCA蛋白定量试剂盒、SDS-PAGE凝胶制备试剂盒，北京索莱宝科技有限公司；发光液，MILLIPORE公司，批号1431401；脱脂奶粉（批号40813059）、TRIS（批号718F081）、甘氨酸（批号119M0611），北京索莱宝科技有限公司。

1.4 仪器

台式高速冷冻离心机（海天美生化仪器设备工程有限公司），ABI7500实时荧光定量PCR仪（美国ABI公司），超低温保存箱（青岛海尔），雪花制冰机（宁波新芝生物科技股份有限公司），微量紫外分光光度计（美国Quawell公司），HH-S2数显恒温水浴锅（江苏正基仪器有限公司），可见分光光度计（上海精密科学仪器有限公司），DYCZ-40D电泳仪、DYCZ-24DN电泳仪、DYY-7C电泳仪电源、摇床（北京六一生物科学技术有限公司），凝胶成像仪（美国BIO-RAD公司）。

2 实验方法

2.1 分组与造模

将90只大鼠按随机数字表法随机分为空白组、模型组、阳性药组和四神丸高、中、低剂量组，每组15只，采用病-证结合方法造模[6-7]。除空白组外，其余各组每日给予100%浓度番泻叶10 mL/kg灌胃、15 mg/kg氢化可的松注射液腹腔注射，空白组给予等量蒸馏水灌胃及生理盐水腹腔注射，连续21 d。21 d后，禁食24 h，乙醚麻醉，取12 cm聚丙烯管（直径2 mm），由肛门插入8 cm左右达结肠部位，快速注入TNBS/乙醇溶液（100 mg/kg），再注入约0.4 mL空气，捏紧肛门，提取大鼠尾巴保持倒立1 min，防止注入液倒流，并使药液与结肠充分接触，待麻醉清醒后正常喂养。

2.2 给药

造模结束后，各治疗组分别给药，给药剂量按人与大鼠体表面积折算。四神丸高、中、低剂量组每日分别按原药材52、26、13 g/kg灌胃，阳性药组每日予SASP混悬液0.36 g/kg灌胃，模型组、空白组予等量蒸馏水灌胃。给药体积均为10 mL/kg，连续21 d。

2.3 标本采集及处理

大鼠禁食24 h后乙醚麻醉。将大鼠固定后采用股动脉采血法取血，室温静置15～20 min，3000 r/min离心10～15 min，取上层血清，用于检测MDA、SOD。之后大鼠脱颈处死，剖取病变最严重处结肠5～8 cm，生理盐水清洗干净，肉眼观察结肠黏膜损伤情况并评分；再将清洗好的结肠放入冻存管中，置于-80 ℃冰箱保存，用于检测TLR-2、TLR-4基因及蛋白的表达。

2.4 结肠黏膜损伤评分

参照文献[8]肉眼评分。0分：无溃疡、充血；1分：局部充血，无溃疡；2分：1处溃疡不伴充血或肠壁增厚；3分：1处溃疡伴炎症；4分：>2处溃疡伴炎症；5分：>2处溃疡和/或炎症>1 cm；6～8分：溃疡和/或炎症>2 cm，病变范围每增加1 cm则计分增加1分。

2.5 血清超氧化物歧化酶、丙二醛测定

采用黄嘌呤氧化法测定大鼠血清SOD活性，采用硫代巴比妥酸比色法测定大鼠血清MDA含量。严格按照试剂说明进行操作。

2.6 RT-qPCR检测Toll样受体2、4 mRNA表达

RNA提取采用传统Trizol法，采用微量紫外分光光度计对RNA含量进行测定，确保其浓度和纯度（OD260/OD280值在1.8～2.0）；按照反转录试剂盒说明书进行反转录，合成cDNA；用荧光定量PCR仪及其分析软件ABI7500进行PCR扩增及定量分析。β-actin引物序列：上游5'-GGACCTGACTGACTACC TACTGAA-3'，下游5'-CTTAATGTCACGCACGATT TCC-3'，产物长度150 bp；TLR-2引物序列：上游5'-TGACCTCTCTCAACGAACTTG-3'，下游5'-CAG CAGGAAAGCAGACTCG-3'，产物长度125 bp；TLR-4引物序列：上游5'-TGGCATCATCTTCATTG TCC-3'，下游5'-CAGAGCATTGTCCTCCCACT-3'，产物长度115 bp。反应体系为cDNA 2 μL，GoTap qPCR Master MIX 10 μL，C×R100×0.2 μL，加无酶水至20 μL。PCR扩增程序：95 ℃、15 s，60 ℃、60 s，95 ℃、15 s，共40个循环。融解曲线温度60～95 ℃。每次扩增均设内参基因组和目的基因组，每一样本均设3个重复。

2.7 Western blot检测Toll样受体2、4蛋白表达

①组织匀浆，提取总蛋白。BCA法检测蛋白含量并将蛋白浓度统一为4 μg/mL后变性待用。②凝胶。根据分子量大小确定分离胶的浓度，待其凝固后再加入浓缩胶，待胶凝固后加样。③跑胶。浓缩胶为80 mA恒压电泳35 min，分离胶为180 mA电泳55 min。④转膜。蛋白凝胶在180 mA条件下转膜100 min，将胶上蛋白转到PVDF膜上，5%脱脂奶粉溶液常温下封闭2 h。⑤一抗孵育。按一抗稀释比例稀释摇床混匀，4 ℃孵育过夜，TBST溶液洗膜8 min×3次。⑥二抗孵育。摇床60 min，TBST溶液洗膜8 min×3次。⑦加入发光液后曝光显影。⑧用Image J软件分析目的条带和β-actin的积分光密度值，并计算二者的比值作为目的蛋白的相对表达量。

3 统计学方法

采用SPSS17.0统计软件进行分析。实验数据以—x±s表示，根据方差齐性检验结果，多组间比较采用方差分析。P<0.05表示差异有统计学意义。

4 结果

4.1 结肠黏膜损伤状况及评分结果

肉眼观察结显示，空白组肠道无增厚粘连，肠黏膜光滑，肠皱襞纹理清晰，未见充血、水肿、糜烂、溃疡等情况；模型组可见肠管增粗增厚，肠黏膜充血、水肿，可见糜烂和溃疡面，部分可见粘连；阳性药组可见轻度充血、水肿；四神丸低剂量组可见轻度充血、水肿，部分可见溃疡面；四神丸中剂量组肠管不厚，未见明显糜烂和溃疡面，可见愈合瘢痕；四神丸高剂量组仅有轻度的充血、水肿，其余损伤基本恢复正常，较四神丸中剂量组稍有差异。与空白组比较，模型组肉眼观察评分明显升高（P<0.01）；与模型组比较，各给药组肉眼观察评分明显降低（P<0.01）。

4.2 四神丸对模型大鼠血清超氧化物歧化酶活性、丙二醛含量的影响

与空白组比较，模型组大鼠血清SOD活性明显降低、MDA含量明显升高（P<0.01）；与模型组比较，各给药组大鼠血清SOD活性明显升高、MDA含量明显降低（P<0.05，P<0.01）。

4.3 四神丸对模型大鼠结肠组织Toll样受体2、4 mRNA表达的影响

与空白组比较，模型组大鼠结肠组织TLR-2、TLR-4 mRNA表达明显升高（P<0.01）；与模型组比较，各给药组大鼠结肠组织TLR-2、TLR-4 mRNA表达明显降低（P<0.05，P<0.01）。

4.4 四神丸对模型大鼠结肠组织Toll样受体2、4蛋白表达的影响

与空白组比较，模型组大鼠结肠组织TLR-2、TLR-4蛋白表达明显升高（P<0.01）；与模型组比较，各给药组TLR-2、TLR-4蛋白表达明显降低（P<0.01）。

5 讨论

UC具有病程长、易反复的特点，病变多发生于结肠和直肠。根据其发病特点，中医学将其归属于“痢疾”“泄泻”等病证范畴。有学者统计，脾肾阳虚型UC的中医证候分布中居首位，高达17.68%[9]。而脾肾阳虚型UC的主要临床表现是畏寒肢凉、腰膝酸软、神疲乏力、食少腹胀、大便溏薄等。这些均与四神丸的主治方向不谋而合。四神丸由补骨脂、肉豆蔻、吴茱萸、五味子加姜、枣组成。方中补骨脂辛苦而温、善补命火、散寒邪，为君药；肉豆蔻温暖脾胃、涩肠止泻，吴茱萸温中散寒，共为臣药；五味子收敛固涩以助止泻，为佐药；生姜温肾散寒，大枣补脾益胃，共为使药。诸药相配，共奏温肾暖脾、涩肠止泻之功。通过查阅相关文献，我们发现，用四神丸或四神丸加减治疗脾肾阳虚型UC具有良好的临床疗效[10]。

氧自由基与UC肠黏膜损伤及炎症发生密切相关，氧自由基可通过脂质过氧化作用破坏生物膜的结构和功能，使细胞内酶失活及蛋白变性而致细胞损伤[11-13]。SOD对机体的氧化与抗氧化平衡起着至关重要的作用，它能清除超氧阴离子自由基O2-，起到保护细胞免受伤害的作用。SOD活性的高低间接反映机体清除氧自由基的能力。MDA作为脂质过氧化物的主要产物，不仅能把活性氧转化成活性化学剂，即非自由基性的脂类分解产物，而且通过链式或链式支链反应，放大活性氧的作用，从而引起细胞代谢或功能障碍，甚至死亡。氧自由基不但通过生物膜中多不饱和脂肪酸的过氧化引起细胞损伤，而且还能通过脂氢过氧化物的分解引起细胞损伤。因此，MDA含量可以反映机体内脂质过氧化程度，间接反映机体细胞受自由基攻击的严重程度。

TLR在天然免疫中具有识别作用，是机体抵抗感染性疾病的第一道屏障。TLR-2主要表达于单核细胞、巨噬细胞、Th1、Th2及部分消化道上皮细胞等，主要识别革兰阳性菌体成分[14]，而TLR-4主要识别革兰阴性菌脂多糖，通过激活TLR-2和TLR-4共同介导的跨膜信号传导通路，介导炎症反应，启动机体的免疫防御系统，产生大量的炎症因子[15]。另外，Toll样受体对获得性免疫应答也具有调控作用。TLR-2和TLR-4能激活树突状细胞（DC）后产生不同的细胞因子和化学激活因子，而TLR4-DC免疫耐受失调被认为是UC免疫失控的重要机制之一。TLR-4主要产生白细胞介素（IL）-12 p70，干扰素-γ介导蛋白（IP-10）及转录干扰素-β；TLR-2刺激则优先表达IL-8和IL-23，这些可溶性细胞因子诱导T辅助细胞向有利于杀灭病原的方向分化产生细胞免疫应答或体液免疫应答。尤其是IL-12和IP-10能够刺激T细胞产生干扰素，促使Th细胞分化为Th1细胞，如果缺乏IL-12则分化为Th2细胞。可见，Toll信号通路在UC的发病中起到至关重要的作用。本研究结果显示，四神丸能升高SOD的活性，降低MDA的含量及结肠组织TLR-2、TLR-4基因及蛋白表达的水平，其治疗UC的机制可能是通过调控TLR信号通道，抑制炎症释放，恢复免疫平衡，达到治疗UC的目的。

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（收稿日期：2015-11-22）

（修回日期：2015-12-17；编辑：华强）