金雀异黄素对肺泡Ⅱ型上皮细胞发生上皮—间质转化的影响

王玲　刘辉国

摘要：目的 观察金雀异黄素对转化生长因子-β1（TGF-β1）诱导人肺腺癌A549细胞发生上皮-间质转化（EMT）的影响，探讨其改善肺纤维化的作用机制。方法 CCK-8法检测不同浓度GEN和/或TGF-β1干预细胞72 h后的活性；RT-PCR检测上皮及间质标记物的转变以及在转变过程中发挥关键调节作用的转录因子；Western blot检测p38及JNK信号通路的变化。结果 TGF-β1连续刺激A549细胞72 h可诱导其转化为成纤维细胞表型，表现出更多间质标记物升高，内皮标记物降低；RT-PCR检测结果显示，金雀异黄素可呈浓度依赖性逆转这种现象；Western blot检测结果显示，金雀异黄素与TGF-β1协同刺激A549细胞24 h可显著抑制TGF-β1诱导p38及JNK信号通路的磷酸化水平。结论 金雀异黄素可抑制TGF-β1诱导A549细胞发生EMT而发挥抗纤维化的作用。

关键词：金雀异黄素；上皮-间质转化；A549；肺纤维化；转化生长因子-β1

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.10.015

中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2016）10-0063-04

Abstract： Objective To investigate the effects of genistein on the epithelium-mesenchyme transition of alveolar type II cells； To discuss its mechanism of improving pulmonary fibrosis. Methods The activity of genistein with different concentrations and TGF-β1 intervention cells after 72 h were determined by CCK-8 method； epithelial and mesenchymal markers as well as the key regulatory factors in the transformation process were determined by RT-PCR； changes of p38 and JNK signaling pathways were determined by Western blot. Results The A549 cells were transformed into fibroblast phenotype stimulated by TGF-β1 for 72 h； mesenchymal markers increased and endothelial marker decreased. The results of RT-PCR indicated that genistein inhibited this phenomenon in a concentration-dependent manner. The results of Western blot showed that， genistein possibly inhibited the epithelial-mesenchymal transition through inhibiting the phosphorylation of p38 and JNK signaling pathways and its downstream transcription factors. Conclusion Genistein has anti-fibrosis effects through inhibiting A549 cells undergoing epithelial-mesenchymal transition.

Key words： genistein； epithelial-mesenchymal transition； A549； pulmonary fibrosis； TGF-β1

特发性肺纤维化（idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）是一种以进行性肺纤维化为主要临床特点的疾病，其主要表现为肺间质成纤维细胞的大量聚集，破坏肺泡结构导致肺功能下降最终导致死亡。有研究表明，从IPF患者中分离出的成纤维细胞具有异质性，多种细胞如骨髓和肺泡上皮细胞在条件刺激下可转变为成纤维细胞[1-2]。其中肺泡上皮细胞在转化生长因子-β1（TGF-β1）刺激下发生上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）而形成的成纤维细胞在IPF中占据一定比例，对肺纤维化的进展发挥重要作用，抑制EMT可显著改善肺纤维化，继而改善肺功能，但目前临床尚缺乏特异性的抗纤维化治疗药物。

金雀异黄素（genistein，GEN）是一种存在于豆科植物和齿状植物中的天然异黄酮化合物，体外实验研究显示，其具有抑制肿瘤细胞增殖的作用[3]。张氏等[4]研究显示，GEN具有抑制大鼠成纤维样滑膜细胞增殖的作用；顾氏等[5]研究显示，GEN对D-半乳糖损伤的乳鼠皮肤细胞成纤维细胞增殖亦具有抑制作用。但GEN是否影响肺纤维化中成纤维细胞的增殖以及EMT现象尚未见研究报道。因此，本实验观察GEN对肺泡Ⅱ型上皮细胞在TGF-β1诱导下发生EMT的影响，探讨其改善肺纤维化的作用机制，为进一步临床治疗肺纤维化提供可靠的实验依据。

1 实验材料

1.1 药物和细胞

GEN，上海融禾医药科技发展有限公司，纯度≥98%，货号446-72-0。A549人肺泡Ⅱ型上皮细胞株，中国科学院上海细胞库，细胞培养和干预刺激均在独立的细胞房中进行，培养环境为37 ℃、5.0%CO2培养箱中。待细胞生长达次融合状态时以0.25%胰蛋白酶消化，根据实验需要接种于不同的培养皿中。分组诱导前以无血清培养基饥饿24 h，减少血清对刺激因素的影响，同时饥饿处理可使细胞同步化。

1.2 主要试剂与仪器

高糖DMEM basic（1×）培养基、新生小牛血清（NBS）、胰酶，Gibco；TGF-β1，PEPROTECH公司；CCK-8试剂盒，日本同仁化学研究所；RT-PCR试剂盒，Roche；p-p38 MAPK、P38、p-JNK、JNK、GAPDH，Cell Signaling Technology公司。多功能微孔板检测系统Synergy HT，美国BioTek公司；恒温培养箱，日本SANYO公司；紫外分光光度计NANODROP 2000c，Thermo scientific；RT反转录仪器Veriti 96 well Thermal Lycler，Applied Biosystems公司；实时定量PCR仪Light Lycler 480，Roche公司；倒置相差显微镜，日本OLYMPUS。

2 实验方法

2.1 细胞处理和分组

待A549细胞贴壁融合达60%～70%时，弃去培养基，PBS清洗，加入饥饿液，置于温箱4 h后置换为含TGF-β1（10 ng/mL）饥饿液（DMEM+0.2%NBS），重新置于温箱中培养，24 h换液1次，72 h后取出蛋白质和RNA样本。实验分为对照组、TGF-β1组、TGF-β1+GEN 1 μmol/L组、TGF-β1+GEN 5 μmol/L组、TGF-β1+GEN 10 μmol/L组和GEN 10 μmol/L组。

2.2 CCK-8法检测

细胞被接种至96孔板中，每孔100 μL，接种密度大约在2×105个/mL，置于温箱继续培养24 h，将培养基更换为无血清的培养基饥饿24 h，采用不同处理因素干预72 h后，将96孔板培养基换为含有10 μL CCK-8的无血清培养基100 μL，继续在温箱中孵育2～2.5 h后于酶标仪波长450 nm处检测。严格按照试剂说明进行操作。

2.3 Western blot检测

冰上裂解细胞10 min，置于1.5 mL离心管，超声裂解仪5 kHz裂解10～15 s，4 ℃、12 000 r/min离心15 min，将上清液移至新的离心管，采用BCA定量法检测蛋白浓度并将蛋白浓度调整一致后置于煮沸仪上将其变性。每组样本混匀后取10 μL行10% SDS-PAGE凝胶电泳，检测内参指标GAPDH，根据各个样本的光密度（OD）值调整上样剂量，使用调整后的上样剂量再行凝胶电泳，使其GAPDH的OD值保持一致，后每组以校正后的上样剂量进行凝胶电泳，将蛋白以100 V、90 min移至PVDF膜，用一抗封闭液（1.5 g牛血清白蛋白溶解于50 mL TBST中）封闭12 h，一抗包括p-p38、p38、p-JNK、JNK，然后用TBST（1 L TBS溶液+1 mL Tween20）洗膜3次，将其放入对应的加有二抗的二抗稀释液（脱脂奶粉溶解于TBST缓冲液中配成2%～5%的液体）中避光孵育1 h，二抗为Alexa Fluor? 488 goat anti- Rabbit IgG，再用TBST洗涤3次，检测目的条带，应用Odyssey图像分析软件检测各组蛋白的OD值。

2.4 RT-PCR检测

细胞以不同因素处理后，弃去培养基，以Trizol法提取细胞总RNA，采用紫外分光光度法测定其含量与纯度。根据样本所测浓度，取适当剂量将各个样本浓度调整一致后反转录为cDNA。以GAPDH为内参照，采用20 μL体系进行PCR扩增。反应条件：94 ℃、2 min；1个循环，94 ℃、40 ；25～35个循环；50 ℃～65 ℃、40 s，72 ℃、1 min，72 ℃、5 min，1个循环。引物序列见表1。

3 统计学方法

采用SPSS17.0统计软件进行分析。实验数据以—x±s表示，多组间均数比较采用方差分析并进行齐性检验，组间两两均数比较方差齐采用SNK法，方差不齐采用Dunnett's T3检验。P<0.05表示差异有统计学意义。

4 结果

4.1 金雀异黄素对A549细胞活性的影响

GEN干预72 h后，与对照组比较，GEN组、GEN和TGF-β1的混合液组A549细胞不同浓度细胞的活性均无明显变化，差异无统计学意义（P>0.05），见表2。

4.2 金雀异黄素对转化生长因子-β1诱导A549细胞发生上皮-间质转化的影响

与TGF-β1组比较，GEN组与TGF-β1协同刺激A549细胞72 h可抑制间质标记物CollagenⅠ、Collagen Ⅲ、Vimentin、Fibronectin的基因表达，促进E-cadherin的基因表达，呈浓度依赖性，见表3。对照组镜下细胞连接紧密，相互黏附性较强，表现为铺路石样；TGF-β1刺激72 h后细胞间紧密连接消失，间隙变大，形态转化为狭长形、纺锤形；TGF-β1与GEN（10 μmol/L）共同刺激72 h后，细胞形态又重新保持上皮细胞特有的形状；单用GEN（10 μmol/L）刺激72 h细胞形态与对照组形态相似。见图1。

4.3 金雀异黄素对转化生长因子-β1诱导的A549细胞p38、JNK信号通路磷酸化水平的影响

GEN与TGF-β1协同刺激A549细胞24 h可显著抑制TGF-β1诱导p38及JNK信号通路的磷酸化水平。

4.4 金雀异黄素对转化生长因子-β1诱导A549细胞转录因子snail1、snail2、twist1、twist2基因表达的影响

TGF-β1干预A549细胞24 h，snail1、snail2、twist1、twist2基因表达较对照组明显升高（P<0.01）；GEN与TGF-β1协同作用则可显著下调上述4种转录因子（P<0.01）；GEN组对以上信号通路及转录因子则无明显影响（P>0.05）。

5 讨论

肺泡上皮细胞通过EMT机制转化而来的成纤维细胞在肺纤维化中发挥着重要作用。本实验结果显示，TGF-β1连续刺激A549细胞72 h可诱导其转化为成纤维细胞表型，表现出更多的间质标记物升高，而上皮标记物降低。RT-PCR检测结果表明，GEN可呈浓度依赖性逆转这种现象；Western blot检测结果显示，GEN与TGF-β1协同刺激A549细胞24 h可显著抑制TGF-β1诱导p38及JNK信号通路的磷酸化水平。以上结果均提示GEN可抑制TGF-β1诱导的A549细胞发生EMT而发挥抗纤维化的作用。

近年来，随着对人体器官纤维化研究的逐步深入，上皮细胞在某些病理情况发生的EMT现象也逐渐得到研究者的关注。上皮细胞在病理因素如TGF-β1的长期慢性刺激下可以失去其原有的极性，细胞间的紧密连接逐渐消失，最终获得一定的迁移和游走能力，具有间质细胞的表型，对肺纤维化起到一定的促进作用，抑制EMT则可显著改善肺功能[6]。本实验结果显示，TGF-β1（10 ng/mL）连续刺激A549细胞72 h后，细胞形态由连接紧凑的铺路石样转化为松散狭长的成纤维细胞形状。RT-PCR检测结果表明，间质标记物CollagenⅠ、Collagen Ⅲ、Vimentin、Fibronectin表达均上调，而上皮细胞标记物E-cadherin表达则下调，由此可以判断TGF-β1可以诱导A549细胞发生EMT，而TGF-β1与GEN同时干预A549细胞72 h则可呈浓度依赖性逆转EMT，上调上皮细胞标记物，下调间质标记物。

无论是永生化的大鼠肺泡型上皮细胞；还是从大鼠分离、培养的肺泡Ⅱ型上皮细胞，以及人肺泡Ⅱ型上皮细胞均可通过TGF-β1诱导上皮细胞EMT，出现成肌纤维细胞的表型[7]。TGF-β1在肺纤维化EMT过程中发挥重要的调节作用。本研究检测了p38及JNK信号通路以及其下游的靶分子的表达，包括snail1、snail2、twist1、twist2，结果发现，TGF-β1刺激A549细胞24 h可显著升高p38及JNK信号通路的磷酸化水平，其下游靶分子snail1、snail2、twist1、twist2表达均上调，而TGF-β1与GEN联合作用时，则可显著降低p38及JNK信号通路的磷酸化水平以及抑制其下游的靶分子。因此，我们认为GEN可能通过抑制p38及JNK信号通路以及其下游的靶分子的表达抑制A549细胞发生EMT。

本研究结果表明，GEN可明显抑制TGF-β1诱导的A549细胞发生EMT，为GEN的大体研究提供了实验依据，但本研究未能阐明其具体的作用机制，这有待于进一步完善相关实验。

参考文献：

[1] KIM K K， KUGLER M C， WOLTERS P J， et al. Alveolar epithelial cell mesenchymal transition develops in vivo during pulmonary fibrosis and is regulated by the extracellular matrix[J]. Proc Natl Acad Sci USA，2006，103（35）：13180-13185.

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[3] SARKAR F H， LI Y. Mechanisms of cancer chemoprevention by soy isoflavone genistein[J]. Cancer Metastasis Rev，2002，21（3/4）：265-280.

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[7] 于婉莹，徐洪，邓海静，等.N-乙酰基-丝氨酰-天门冬氨酰-赖氨酰-脯氨酸对人肺泡Ⅱ型上皮细胞向肌成纤维细胞转化的调节作用[J].解剖学杂志，2013，36（4）：711-715.

（收稿日期：2016-02-23；编辑：华强）