不同浓度瑞芬太尼对新生大鼠海马区神经干细胞内钙浓度及细胞凋亡的影响

昌睿杰 ，姚雪芹 ，蒙臣 ，陆江 ，李清

(1.湖北省十堰市太和医院，湖北 十堰　442000；2.湖北医药学院麻醉学研究所，湖北 十堰　442000)



不同浓度瑞芬太尼对新生大鼠海马区神经干细胞内钙浓度及细胞凋亡的影响

昌睿杰1,2，姚雪芹1,2，蒙臣1,2，陆江2，李清1,2

(1.湖北省十堰市太和医院，湖北 十堰442000；2.湖北医药学院麻醉学研究所，湖北 十堰442000)

目的探讨不同浓度瑞芬太尼对新生大鼠海马区神经干细胞凋亡及细胞内钙浓度的影响。方法采用已建立的新生SD大鼠海马区神经干细胞单细胞克隆系细胞株，将5×108个·L-1活细胞的密度均匀地接种到的12孔培养板中，每孔加入1 mL含有10%胎牛血清的DMEM/F12的培养基，放入温度37℃、5%浓度CO2培养箱中孵育24 h，镜下观察细胞球贴壁后，每孔分别加入生理盐水或不同浓度的瑞芬太尼(R)，分为以下4组：(1)对照组，每孔加入生理盐水；(2)低浓度组，每孔加入瑞芬太尼5 μg·L-1，即R5组；(3)中浓度组，每孔加入瑞芬太尼10 μg·L-1，即R10组；(4)高浓度组，每孔加入瑞芬太尼20 μg·L-1，即R20组。每组重复4次。加药后培养300、600、900 s用激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)检测各组神经干细胞内游离钙浓度的动态变化，24 h后流式细胞仪检测各组神经干细胞的凋亡情况。结果(1)各组细胞内钙浓度变化情况：与对照组比较，R5组细胞内钙浓度差异无统计学意义(P>0.05)；R10、R20组细胞内钙浓度明显升高(其中R10组P<0.05 ，R20组P<0.01)。(2)各组神经干细胞凋亡变化情况：与对照组比较，R5组神经干细胞凋亡差异无统计学意义(P>0.05)；R10、R20组神经干细胞凋亡明显升高(其中R10组P<0.05 ，R20组P<0.01)。结论低浓度的临床有效血药浓度的瑞芬太尼对新生大鼠海马区神经干细胞内钙浓度、细胞凋亡没有影响，中高浓度的临床有效血药浓度的瑞芬太尼应用使细胞内钙浓度显著升高，从而诱发细胞大量凋亡。

瑞芬太尼;海马;神经干细胞;细胞凋亡;钙;大鼠,Sprague-Dawley

随着现在小儿(新生儿和婴幼儿)手术的开展越来越广泛，全麻药物瑞芬太尼在小儿手术的应用日益普遍，“瑞芬太尼是否影响小儿脑发育”逐渐成为麻醉关注的热点[1]。神经干细胞(neural stem cells,NSCs)存在于中枢神经系统，其与脑发育密切相关。瑞芬太尼的镇痛作用主要集中在中枢的边缘系统，其临床推荐使用剂量范围广[2]，其有效血药浓度为1～20 μg·L-1，瑞芬太尼对小儿神经发育的影响目前尚不清楚。本实验拟观察不同临床有效血药浓度的瑞芬太尼对新生大鼠海马区神经干细胞内钙离子浓度的变化及其存活、凋亡的影响,探讨小儿临床麻醉用药的安全性、合理性。

1　材料与方法

1.1细胞株接种(1)采用湖北医药学院麻醉学研究所提供的新生SD大鼠海马区神经干细胞单细胞克隆系细胞株的细胞球悬液吸入30 mL灭菌离心管中加盖直立静放10 min。(2)待细胞球完全下沉至管底后(必要时离心)，轻轻吸去4/5上清液，加入神经干培养液定容至10 mL，用毛细吸管轻轻吹打神经球机械分离克隆，相差显微镜下观察制备成单细胞或多细胞球悬液。(3)用台盼蓝染色后进行细胞计数， 5×108个·L-1活细胞的密度接种于不放盖玻片多聚赖氨酸包被的12孔培养板中，每孔加1.0 mL含 10%胎牛血清+DMEM/F12诱导分化的培养基，放入5% CO2、饱和湿度的37 ℃培养箱中孵育使细胞贴壁。

1.2药物处理与分组(1)上述细胞孵育6～8 h镜下观察完全贴壁后，分随机组后每孔加入不同药物处理(对照组记为C，低浓度瑞芬太尼记为R5，低浓度瑞芬太尼记为R10，低浓度瑞芬太尼记为R20)。(2)分为4组(每组3孔细胞)：C组：加入生理盐水；R1组:加入瑞芬太尼5 μg·L-1;R2组:加入瑞芬太尼10 μg·L-1;R3组:加入瑞芬太尼20 μg·L-1。

1.3指标检测

1.3.1激光扫描共聚焦技术(LSCM) 检测神经细胞内内Ca2+浓度的动态变化

(1) NSCs于室温下培养24 h，吸弃培养液，用Lock’s 液洗二遍，加入100 μL Lock’s 液(含5 μmol ·L-1的Fluo-3 /AM 存储液，Fluo-3 /AM 为可以穿透细胞膜的高亲钙荧光染料)。(2)NSCs置于细胞培养箱中孵育45 min后吸去荧光染料，用Lock’s液洗2遍，每孔加入100 μL的Lock’s液后使用激光扫描共聚焦显微镜对细胞进行扫描。扫描开始3 min后，分别使用10 μL的生理盐水和5、10、20 μg·L-1的瑞芬太尼处理NSCs。每隔10 s扫描一次，持续15 min。(3)将所得荧光图像用Leica SP2 Confocal 软件进行分析。扫描30个未经处理NSCs，统计其细胞内Ca2+荧光信号强度平均值作为基础值并设置为1，将药物处理后300、600、900 s的细胞内Ca2+荧光信号强度与基础值进行比较。

1.3.2流式细胞技术检测细胞凋亡[3]

细胞按上述分组加药，培养30 min后按以下步骤进行：(1)吸去培养孔培养液，先用PBS缓冲液清洗2次，用0.125%胰酶消化细胞5 min；(2)镜下观察细胞松动收缩或悬浮变圆后，用无钙PBS缓冲液终止消化，轻轻吹打成细胞悬液；(3)500 r·min-1低速离心5 min后吸除上清液，再无钙PBS缓冲液清洗2次；(4)收集上述处理各组细胞于无钙PBS中重悬，并将调整细胞密度为5×108个·L-1；(5)分别取上述各组细胞悬液1ml于对应编号的小试管中，在避光环境里分别加入终浓度Fluo2-AM 10 μmol·L-1，在CO2培养箱中孵育1 h(避光，37 ℃)并间断轻轻振荡几次；(6)取出上述染色后各组细胞悬液再离心，用无钙PBS缓冲液清洗3次以去除多余的染料；(7)再用无钙PBS缓冲液重悬上述各组细胞至1 mL，按分组于流式细胞仪上进行检测，设置发射波长为526 nm，激发波长为506 nm；随机取1万个细胞测定每个细胞荧光强度值，其各组测定值为荧光强度值的平均值。

表1　不同浓度瑞芬太尼对NSCs内Ca2+水平的影响

注：a表示与Ca2+基础水平比较；b表示与相同时间点的对照组比较。

2　 结果

2.1各组细胞内钙浓度变化情况由表1可见：与C组比较，R5组细胞内钙浓度差异无统计学意义(P>0.05)；R10、R20组细胞内钙浓度明显升高(其中R10组P<0.05 ，R20组P<0.01)。

2.2各组神经干细胞凋亡变化情况见图1，与C组比较，R5组神经干细胞凋亡差异无统计学意义(P>0.05)；R10、R20组神经干细胞凋亡明显升高(其中R10组P<0.05 ，R20组P<0.01)。

NSCs经生理盐水(A，Control)及5 μg·L-1(B，R5)、10 μg·L-1(C，R10)、20 μg·L-1(D，R20)的瑞芬太尼处理24 h,使用Annexin-Ⅴ和PI标记细胞并用流式细胞技术检测。(E)流式细胞技术结果统计。

图1　不同浓度瑞芬太尼对NSCs凋亡的影响

3　讨论

在本实验中，我们通过使用不同浓度的瑞芬太尼处理新生大鼠海马区的神经干细胞，发现低浓度的瑞芬太尼对新生大鼠海马区神经干细胞内钙浓度、细胞凋亡没有影响，而中高浓度的瑞芬太尼使细胞内钙浓度显著升高，且细胞大量凋亡。

麻醉药物如氟烷、N2O、异氟醚、丙泊酚等对实验动物快速发育期的大脑都有敏感的神经毒性，可诱发未成熟大脑神经细胞死亡及发育后学习认知功能受损，且损害程度与剂量成正相关[4-5]。瑞芬太尼是新型超短效型的阿片受体激动药，其对发育期大脑的影响目前还不十分清楚。目前，临床上已普遍使用瑞芬太尼作为小儿麻醉镇痛，且推荐使用的有效血药浓度横跨1～20 μg·L-1的广泛区间[2]，因此，该实验选取了该区间范围内的低(5 μg·L-1)、中(10 μg·L-1)、高(20 μg·L-1)三种不同剂量进行干预。瑞芬太尼主要作用于中枢神经的边缘系统[2]，而海马组织是边缘系统的重要组成部分，其结构特殊，是调控大脑学习认知功能的关键区域，而且在脑内对损伤也最为敏感[6]。因此，本实验选取新生海马区域的细胞作为研究靶点。

研究已证实，海马中的内源性神经干细胞与学习记忆和认知功能有极密切的关系[7]。神经干细胞是神经元的前体细胞，在发育期，海马中有大量的神经干细胞分化为神经元细胞，这些新生的神经元细胞直接影响认知功能(包括学习和记忆)的构建。而当神经干细胞受损如发生凋亡坏死时，大脑的认知功能发育也会明显受限[7]。因此，为了探讨瑞芬太尼对发育期大脑认知功能的潜在影响，我们选取海马齿状回的神经干细胞作为研究对象。

在本实验中，我们观察到，低浓度的瑞芬太尼对神经干细胞的凋亡没有明显影响，而经中高临床浓度的瑞芬太尼处理后，神经干细胞发生了明显凋亡。这说明，在使用的临床对应剂量中，中高浓度的瑞芬太尼会对体外培养的海马区神经干细胞产生明显的毒性作用。这提示我们，在临床小儿麻醉中，使用较低有效浓度的瑞芬太尼对神经发育是比较安全的，而使用高浓度的瑞芬太尼除了导致痛觉敏化等副作用外，还使小儿面临着学习认知功能发育受损的风险，这将指导我们设计严密的临床实验作详细证实。

在进一步的实验检测中，我们发现中高临床浓度的瑞芬太尼能够引起海马区神经干细胞内的Ca2+浓度显著升高，而低浓度瑞芬太尼对细胞内Ca2+水平没有影响，这很可能是中高浓度瑞芬太尼诱导神经干细胞凋亡的主要原因。研究发现，细胞内Ca2+浓度与凋亡反应密切相关[8-9]。游离钙离子作为细胞内外信号转导通路的信使，广泛参与了神经干细胞的生理过程。正常情况下，细胞内Ca2+维持在较低水平，其浓度在生理范围内的升高可以促进细胞增殖分化与合成分解代谢等正常生理过程[10-11]；而细胞内游离Ca2+浓度升高至钙超载时将触发一系列病理生理变化，其典型表现为诱导细胞凋亡[12]。研究已证实，阿片类药物可以刺激神经细胞的钙内流，细胞内Ca2+浓度越高，细胞凋亡越明显[13]，本实验结果与完全吻合。

综上所述中高浓度的瑞芬太尼使新生大鼠神经干细胞细胞内钙浓度显著升高，细胞大量凋亡；低浓度的瑞芬太尼对神经干细胞内钙浓度、细胞凋亡没有影响。因此在小儿围手术期推荐使用低浓度的瑞芬太尼是安全合理的。

[1]Jevtovic Todorovic V,Hartman RE,Izumi Y,et al.Early exposure to common anesthetic agents causes wide spread neurodegeneration in the developing rat brain and persistent learning deficits[J].J Neuroscis,2003,23(3):876-882.

[2]于颖群，徐建国，雷米.芬太尼的药理及临床应用[J].临床麻醉学杂志，2000，16(6)：240-241.

[3]Turner JE,Morrison PJ,Wilhelm C,et al.IL-9-mediated survival of type 2 innate lymphoid cells promotes damage control in helminth-induced lung inflammation[J].Exp Med,2013,210(13):2951-2965.

[4]谢玉波,陶红蕾,陈静,等.丙泊酚对大鼠空间学习记忆及海马钙调蛋白依赖性激酶Ⅱ的影响[J].中华麻醉学杂志,2008,24(7):617-619.

[5]Bali M,Akabas MH.Defining the propofol binding site location on the GABAAreceptor[J].Mol Pharmacol,2004,65(1):676-689.

[6]Zhu XH,Yan HC,Zhang J,et al.Intermittent hypoxia promotes hippocampal neurogenesis and produces antidepressant-like effects in adult rats[J].Neurosci,2010,30:12653-12663.

[7]Tan S,Xu C,Zhu W,et al.Endocrine and neurobehavioral abnormalities induced by propofol administered to neonatal rats[J].Anesthesiology,2014,121:1010-1017.

[8]Liebau S,Tischendorf M,Ansorge D,et al.An inducible expression system of the calcium-activated potassium channel 4 to study the differential impact on embryonic stem cells[J].Stem Cells Int, 2011,2011:456815.

[9]Huang T,Xie Z,Wang J,et al.Nuclear factor of activated T cells(NFAT) proteins repress canonical Wnt signaling via its interaction with Dishevelled(Dvl) protein and participate in regulating neural progenitor cell proliferation and differentiation[J].Biol Chem,2011,286(43):37399-37405.

[10] Weissman T,Riquelme P,Ivic L,et al.Calcium waves propagate through raial glial cells and modulate proliferation in the developing neocortex[J].Neuron,2004,43(5):647-661.

[11] Piper D,Mujtaba T,Rao MS,et al.Immunocytochemical and physiological characterization of a population of cultured human neural precursors[J]. Neurophysiol,2000,84(1):534-548.

[12] Desfeux A,EI Ghazi F,Jegous H,et al.Dual effect of glutamate on GABAergic interneuron in mice neonates[J].Cere Cortex,2010,20(5):1092-1108.

[13] Wandless AL,Smart DG.Fentanyl increases intracellular Ca2+concentrations in SH-SY5Y cells[J].Anesth,1997,76(3):461-463.

Effect of different clinical doses of remifentanil on the intracellular Ca2+concentration and apoptosis in newborn rat hippocampal neural stem cells

CHANG Ruijie1,2,YAO Xueqin1,2,MENG Chen1,2,et al

(1.TaiheHospital,Shiyan,Hubei442000,China;2.AnesthesiologyResearchInstituteofHubeiUniversityofMedicine,Shiyan,Hubei442000,China)

ObjectiveTo investigate the effect of different clinical doses of remifentanil on the apoptosis and the related intracellular Ca2+concentration([Ca2+]i) in newborn rat hippocampal neural stem cells(NSCs).MethodsThe hippocampal monoclonal NSCs strains of newborn SD rat were seeded into 12-well plates at the density of 5×105cells/well,and cultured with 1 mL of DMEM/F12 medium containing 10% fetal bovine serum.NSCs were incubated in humidified incubator at 37 °C with 5% CO2for 24 hours.Cells were assigned into four groups by different treatments as follows:(1) control group:NSCs were treated by saline;(2) low dose group(R5group):NSCs were stimulated with 5 μg·L-1of remifentanil;(3) middle dose group(R10group):NSCs were incubated in 10 μg·L-1of remifentanil;(4) high dose group(R20group):NSCs were stimulated with 20 μg·L-1of remifentanil.In every group the treatment was repeated for four times.Laser scanning confocal microscope(LSCM) scanning was used after 300 s,600 s and 900 s of remifentanil treatment for detection of [Ca2+]i.NSCs apoptosis was assayed by flow cytometry 24 hours after the treatment of remifentanil.ResultsCompared with control group,R5group showed no significant changes in [Ca2+]i(P>0.05) and the concentrations of [Ca2+]iof NSCs in R10and R20group were increased markedly (P<0.05 andP<0.01,respectively).Compared with control group,NSCs in R5group were almost not impaired,while the apoptosis of NSCs was significantly increased in R10and R20group(P<0.05 andP<0.01,respectively).ConclusionsLow clinical dose of remifentanil has little effect on NSC apoptosis and the related [Ca2+]i,while the middle and high doses of clinical remifentanil notably increase the level of [Ca2+]i,resulting in significant apoptosis in NSCs.

Remifentanil;Hippocampus;Neural stem cells;Apoptosis;Calcium;Rats,sprague-dawley

湖北省自然科学基金项目(2012FFC060)；湖北省省级重点学科项目(2014XKJSSJ04)

李清，教授，硕士研究生导师，研究方向：麻醉学，E-mail:liqing8801@163.com

10.3969/j.issn.1009-6469.2016.09.006

2016-03-09，

2016-06-20)