不同光照下外源茉莉酸类物质对兴安落叶松防御蛋白的影响1)

崔伟婵 李霜雯 严善春

(东北林业大学，哈尔滨，150040)



不同光照下外源茉莉酸类物质对兴安落叶松防御蛋白的影响1)

崔伟婵 李霜雯 严善春

(东北林业大学，哈尔滨，150040)

为了探究光照和外源茉莉酸类物质对兴安落叶松(Larixgmelinii)防御蛋白的协同影响，借助自然光照和遮荫处理，模拟林地自然环境中不同郁闭度下的光照条件。在不同的光照条件下，在落叶松盆栽苗上喷施茉莉酸(JA)和茉莉酸甲酯(MeJA)，以喷施蒸馏水为对照，测定落叶松针叶内防御蛋白酶活性的变化。结果表明：遮荫条件下，落叶松针叶内防御蛋白活性均显著高于自然光照下的(p<0.05)。超氧化物歧化酶(SOD)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)和胰蛋白酶抑制剂(TI)活性在光照强度为自然光照的25%时达到最大值，过氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)和胰凝乳蛋白酶抑制剂(CI)的活性均在50%光照强度下达到最大值。在相同光照条件下，喷施MeJA和JA后，SOD、PPO和PAL的活性均显著高于对照(p<0.05)，POD与蛋白酶抑制剂CI和TI活性在相同光照条件下喷施诱导剂后，显著低于对照(p<0.05)。总体来看，防御蛋白对MeJA的响应强于JA。喷施MeJA和JA后，SOD和PAL在25% 自然光照下活性最大，PPO在50%自然光照下活性最大。表明不仅光照和MeJA、JA在单独存在时影响落叶松防御蛋白的活性，而且在光照与MeJA或JA同时存在时对落叶松防御蛋白还存在交互影响。在遮荫条件下喷施MeJA诱导效果优于JA。在生产中适当加大林分的郁闭度，适时喷施外源茉莉酸甲酯，能够提升兴安落叶松的化学防御能力，达到抵御害虫危害的目的。

兴安落叶松；诱导抗性；光照强度；茉莉酸；茉莉酸甲酯

In order to better understand the induced resistance in larch trees against insects, we studied the potential effect of jasmonic acid and methyl jasmonate on bio-activity of defensive proteins (induced resistance) inL.gmeliniiseedlings under the different light conditions. The activities of all the defensive proteins under a shaded condition were significantly higher than those at the natural light intensity (P<0.05). The activities of SOD, PAL and TI reached the highest values under the 25% natural light condition, while the activities of POD, PPO and CI reached the highest values at the 50% natural light intensity. After spraying MeJA and JA, the activities of SOD, PPO and PAL under the same light condition were significantly higher than those in CK, but POD, CI and TI were lower than those in CK. The responses from defensive proteins to MeJA were stronger than to JA. The protein activity was highest at the 25% light intensity for SOD and PAL, and at the 50% light intensity for PPO. Both two single factors (light and induce) and their synergistic interaction significantly influence the activity of defensive proteins. Thus, increasing the canopy density and spraying exogenous inducers simultaneously in practice might increase the induced resistance ofL.gmeliniitree against insect attack by increasing the activity levels of their defensive proteins.

兴安落叶松(Larixgmelinii)是我国东北部一种耐寒、耐旱和生长迅速的用材树种，具有重要的经济和生态价值。在兴安落叶松的生长过程中，常遭受舞毒蛾(Lymantriadispar)、落叶松毛虫(Dendrolimussuperans)等多种害虫的危害，影响落叶松林健康生长。在植物与昆虫共同进化过程中，植物本身形成一套自己的防御系统，抵御昆虫的危害[1-2]。植物在受到昆虫伤害后，会产生诱导抗性[3]。人为将外源愈伤激素茉莉酸类化合物喷施在植物上，可以产生与昆虫伤害类似的诱导作用，诱导植物产生各种化学防御反应[4-6]。王杰等[7]研究发现，用外源茉莉酸局部喷施长白落叶松幼苗后，可系统诱导增强其防御蛋白的活性。用不同诱导因子处理落叶松(Larixgmelinii)，其防御物质的变化存在一定差异[8-9]。

光照是生物生存的重要能量来源，对植物各个方面起着重要的作用，同样也会影响植物诱导抗性的应答反应。鲁艺芳等[10]研究发现，低光照强度能够显著提高落叶松针叶内防御蛋白酶的活性，从而有效地提升其自主抗性。当光照强度与外源茉莉酸类物质同时作用时，对兴安落叶松针叶内防御蛋白活性将产生什么样的影响？尚未见报道。本研究分析了在不同光照强度下，喷施茉莉酸(JA)和茉莉酸甲酯(MeJA)后，兴安落叶松针叶内防御蛋白酶活性的变化，探讨2种因子的交互作用对兴安落叶松诱导抗性的影响，为落叶松林的科学管理和害虫防治奠定基础。

1 材料与方法

1.1 样地设置及对供试落叶松苗的处理

5月上旬，在黑龙江省平山林药厂鱼塘边的空地上，选择土壤条件一致、平整的3块区域作为样地，分别记为样地A、B和C，每块样地面积为15 m×7 m。A样地为100%自然光照(无遮荫网)，记为NS；B和C样地各搭建一个遮荫棚，B样地光照强度为自然光照的50%，1层遮荫网，记为NS1；C样地光强度为自然光照的25%，2层遮荫网，记为NS2，分别模拟林缘、林窗和林下3种不同光照环境，如图1。光照强度采用TES-1335型数字照度计进行测定。将4年生的兴安落叶松树苗栽植于塑料花盆中，花盆直径为23 cm，高度为31 cm。在每块样地内摆放300盆树苗，分为3组，每100盆为1组；相邻组的间距为1 m，用塑料布进行隔离。待树苗恢复生长1个月后，在3块样地的3组苗上，分别喷施蒸馏水和诱导剂0.01 mol·L-1JA、1 mmol·L-1MeJA，记为CK、JA和MeJA。落叶松苗的处理方法参照冯春富等[11]和孟昭军等[12]。在每块样地随机选取落叶松苗采集针叶，每5株为1个重复，重复3次。将采集的针叶置于夹链袋内，标记编号，放在冰盒中，带回实验室，-20 ℃低温保存，待测。

图1 试验样地A、B、C设计示意图

1.2 防御蛋白活性的测定方法

1.2.1 保护酶活性测定

取1 g新鲜针叶样品置于研钵中，在液氮充分冷冻下碾碎。超氧化物歧化酶(SOD)活性测定用氮蓝四唑染色法和过氧化氢氧化法[13]。过氧化物酶(POD)活性测定用愈创木酚法[14]，并略作改动。测定酶活性时，加入SOD与POD酶液量均为1 mL。

1.2.2 防御酶活性测定

取1 g新鲜针叶样品置于研钵中，在液氮充分冷冻下碾碎。多酚氧化酶(PPO)活性测定用咖啡酸比色法[15]。苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性测定参照Zong et al.[16]的苯丙氨酸比色法。酶活性测定时，PPO与PAL加入酶液量分别为0.3、0.2 mL。

1.2.3 蛋白酶抑制剂活性测定

胰蛋白酶抑制剂(TI)和胰凝乳蛋白酶抑制剂(CI)活性测定方法分别参考张健等[17]的方法，并略作改动。分别取TI酶液120 μL，CI酶液50 μL，分别与80 μL酶抑制剂混合，进行酶活性测定。TI在256 nm处测定其OD值，CI在253 nm处测定其OD值。

1.3 数据处理

运用GraphPad Prism与SPSS 18.0软件，采用单因变量多因素方差分析不同光照强度、药剂处理对落叶松针叶内保护酶、防御酶和蛋白酶抑制剂活性的影响，以LSD(最小显著法)和Duncan在95%置信区间下检验不同处理之间的差异显著性。

2 结果与分析

2.1 光照强度与茉莉酸类化合物对兴安落叶松针叶中主要防御蛋白活性的主效应

由表1可见，光照强度和诱导剂对POD、TI和CI的活性均有极显著影响(p<0.01)，对SOD、PAL的活性具有显著影响(p<0.05)，对PPO的活性影响不显著；光照强度与诱导剂这2个因素协同作用对POD和TI均有极显著影响(p<0.01)，对CI有显著影响(p<0.05)，说明这2个因素之间存在交互作用。

表1 影响兴安落叶松针叶中主要防御蛋白活性变化的主效应

2.2 光照强度与茉莉酸类化合物对兴安落叶松针叶内防御酶活性的协同影响

2.2.1 对保护酶活性的影响

在相同诱导剂下，SOD活性随着光照强度的减弱而提高，在遮荫条件下NS1、NS2显著高于自然光照NS(p<0.05)，NS2高于NS1，但差异不显著；POD活性则在NS1条件下达到最大值(表2)。在光照强度相同时，与对照组(CK)相比，JA和MeJA均显著诱导增强了落叶松针叶内SOD活性，而POD活性显著降低(p<0.05)。说明在遮荫环境下喷施诱导剂，可以诱导SOD的形成，且MeJA诱导效果优于JA诱导效果。

表2 不同光照强度下喷施茉莉酸类物质对兴安落叶松针叶内保护酶活性的影响

注：表中数据为平均值±标准误。数据后不同大写字母表示相同光照条件下不同茉莉酸类物质处理后落叶松针叶内保护酶活性之间差异显著(p<0.05)；不同小写字母表示相同茉莉酸类物质不同光照强度下落叶松针叶内保护酶活性之间差异显著(p<0.05)。

2.2.2 对防御酶活性的影响

在相同诱导剂下，PPO活性在NS1条件下达到最大值；PAL活性随着光照强度的减弱而增强，但差异并不显著(表3)。在相同光照条件下，与CK相比，JA和MeJA均显著诱导增强了PPO和PAL活性(p<0.05)，说明在遮荫条件下，喷施MeJA和JA均能诱导增强PPO和PAL的活性，且MeJA的诱导效果优于JA。

表3 不同光照强度下喷施茉莉酸类物质对兴安落叶松针叶内防御酶活性的影响

注：表中数据为平均值±标准误。数据后不同大写字母表示相同光照条件下不同茉莉酸类物质处理后落叶松针叶内防御酶活性之间差异显著(p<0.05)；不同小写字母表示相同茉莉酸类物质不同光照强度下落叶松针叶内防御酶活性之间差异显著(p<0.05)。

2.2.3 对蛋白酶抑制剂活性的影响

在相同诱导剂下，随着光强度减弱，处理组兴安落叶松针叶内TI活性显著增强，且差异均显著(p<0.05)；CI活性NS1、NS2显著高于NS，在NS1条件下达到最大值(表4)。在相同光照条件下，与CK相比，诱导均降低或显著降低了CI和TI活性(p<0.05)，且MeJA诱导处理的酶活性显著低于JA(p<0.05)。说明，JA和MeJA抑制了TI和CI酶的形成，且MeJA抑制效果强于JA。

表4 不同光照强度下喷施茉莉酸类物质对兴安落叶松针叶内蛋白酶抑制剂活性的影响

注：表中数据为平均值±标准误。数据后不同大写字母表示相同光照条件下不同茉莉酸类物质处理后落叶松针叶内蛋白酶抑制剂活性之间差异显著(p<0.05)；不同小写字母表示相同茉莉酸类物质不同光照强度下落叶松针叶内蛋白酶抑制剂活性之间差异显著(p<0.05)。

3 结论与讨论

光照强度的改变会影响植物的化学防御体系，使其抗性发生变化。鲁艺芳等研究发现，遮荫处理组的兴安落叶松叶内防御蛋白活性均显著高于未遮阴处理组[9]；遮荫处理后的兴安桧叶内保护酶活性亦均显著高于对照组[18]，与本研究结果一致。

外源JA或MeJA能诱导植物增强抗性，使植物有效地抵御害虫危害。据研究报道，外源JA或MeJA可以促进番茄(Lycopersiconesculentum)、茶树(Camelliasinensis)、马铃薯(Solanumtuberosum)、水稻(Oryzasativa)、烟草(Nicotianatabacum)和棉花(Gossypiumspp.)幼苗等植株对昆虫的抗性[19-24]。本研究结果显示，在遮荫条件下，喷施JA和MeJA能诱导增强落叶松针叶内SOD、PPO和PAL的活性，且MeJA诱导效果优于JA；而对POD、TI和CI的活性却表现为诱导抑制作用。不同光照强度与外源JA和MeJA对兴安落叶松体内防御蛋白活性存在交互作用，而且在这2个因子交互作用下的兴安落叶松显著干扰了舞毒蛾的排毒代谢酶的活性(另文发表)。因此，在生产实践中，可以通过营林措施适当提高造林密度，加大落叶松林分郁闭度，增强林木自身的防御能力；在虫害暴发前，在落叶松上适当喷施茉莉酸甲酯来诱导增强其抗虫性，达到抵御害虫危害的目的。

[1] 钦俊德,王琛柱.论昆虫与植物的相互作用和进化的关系[J].昆虫学报,2001,44(3):360-365.

[2] 王琪,严善春,徐波.红松的化学防御及冷杉梢斑螟和赤松梢斑螟的生存策略[J].林业科学,2012,48(7):79-85.

[3] 邓文红,沈应柏,李镇宇,等.虫食与熏蒸对马尾松苗木针叶酚酸含量的影响[J].北京林业大学学报,2010,32(1):39-43.

[4] BIRKETT M A, CAMPBELL C A M, CHAMBERLAIN K, et al. New roles for cis-jasmone as an insect semiochemical and in plant defense[J]. PNAS,2000,97(16):9329-9334.

[5] KOCH T, KRUMM T, JUNG V, et al. Differential induction of plant volatile biosynthesis in the lima bean by early and late intermediates of the octadecanoid-signaling pathway[J]. Plant Physiology,1999,121(1):153-162.

[6] KESSLER A, BALDWIN I T. Plant responses to insect herbivory: The emerging molecular analysis[J]. Annual Review of Plant Biology,2002,53:299-328.

[7] 王杰,孟昭军,王琪,等.外源茉莉酸诱导方式对长白落叶松针叶内防御蛋白活力的影响[J].东北林业大学学报,2015,43(5):84-89.

[8] 王琪,严善春,金虎,等.叶损伤对兴安落叶松防御酶活性的系统诱导[J].东北林业大学学报,2012,40(9):77-80.

[9] 王琪,严善春,王艳军,等.剪叶及昆虫取食对兴安落叶松蛋白酶抑制剂的影响[J].昆虫学报,2008,51(8):798-803.

[10] 鲁艺芳,石蕾,严善春.不同光照强度对兴安落叶松几种主要防御蛋白活力的影响[J].生态学报,2012,32(11):3621-3627.

[11] 冯春富,严善春,毛洪波,等.落叶松诱导抗性对舞毒蛾生长发育的影响[J].东北林业大学学报,2010,38(5):136-137.

[12] 孟昭军,周永泉,严善春,等.外源茉莉酸类化合物对2种落叶松针叶内单宁含量的影响[J].林业科学,2010,46(3):96-104.

[13] 王晶英,敖红,张杰,等.植物生理生化实验技术与原理[M].哈尔滨:东北林业大学出版社,2003.

[14] 李合生.植物生理生化实验原理和技术[M].北京:高等教育出版社,2000.

[15] FELTON G W, DONATO K K, BROADWAY R M, et al. Impact of oxidized plant phenolics on the nutritional quality of dietary protein to a noctuid herbivoreSpodopteraexigua[J]. Journal of Insect Physiology,1992,38(4):277-285.

[16] ZONG N, WANG C Z. Larval feeding induced defensive responses in tobacco: comparison of two sibling species ofHelicoverpawith different diet breadths[J]. Planta,2007,226(1):215-224.

[17] 张健,严善春,王琪.落叶松结实量对其防御酶和蛋白酶抑制剂活力的影响[J].林业科学,2009,45(8):96-100.

[18] 贾传华,郭太君,王刚,等.不同遮荫处理对兴安桧叶绿素含量和保护酶活性的影响[J].吉林农业大学学报,2010,32(3):264-267,283.

[19] THALER J S. Induced resistance in agricultural crops: Effects of jasmonic acid on herbivory and yield in tomato plants[J]. Environmental Entomology,1999,28(1):30-37.

[20] 桂连友,陈宗懋,刘树生.外源茉莉酸甲酯处理茶树对茶尺蠖幼虫生长的影响[J].中国农业科学,2005,38(2):302-307.

[21] ROYO J, LEON J, VANCANNEYT G, et al. Antisense-mediated depletion of a potato lipoxygenase reduces wound induction of proteinase inhibitors and increases weight gain of insect pests[J]. Proc Natl Acad Sci USA,1999,96(3):1146-1151.

[22] WU J S, WANG L, BALDWIN I T. Methyl jasmonate-elicited herbivore resistance: does MeJA function as a signal without being hydrolyzed to JA[J]. Planta,2008,227(5):1161-1168.

[23] 徐涛,周强,陈威,等.茉莉酸信号传导途径参与了水稻的虫害诱导防御过程[J].科学通报,2003,48(13):1442-1446.

[24] 杨世勇,王蒙蒙,谢建春.茉莉酸对棉花单宁含量和抗虫相关酶活性的诱导效应[J].生态学报,2013,33(5):1615-1625.

Effects of Exogenous Jasmonic Acid and Methyl Jasmonate on the Defensive Proteins ofLarixgmeliniiunder Different Light Conditions//

Cui Weichan, Li Shuangwen, Yan Shanchun

(Northeast Forestry University, Harbin 150040, P. R. China)//Journal of Northeast Forestry University，2016,44(9)：78-81.

Larixgmelinii; Induced resistance; Light intensities; Jasmonic acid; Methyl jasmonate

崔伟婵，女，1991年6月生，东北林业大学林学院，硕士研究生。E-mail：cuiweichandoudou@126.com。

严善春，东北林业大学林学院，教授。E-mail：yanshanchun@126.com。

2016年 5月5日。

S763.712;S763.22

1)国家公益性行业科研专项(200904021)。

责任编辑：程 红。