SHMT1基因启动子的rs638416位点与先天性心脏病的相关性

(姜钰超　匡乐乐　王红艳　段文元　蔡春泉

(1复旦大学生命科学学院遗传学系　上海　200433; 2 天津市儿童医院外科　天津　300074;3 济南军区总院心血管病研究所 济南　250031)



SHMT1基因启动子的rs638416位点与先天性心脏病的相关性

(姜钰超1匡乐乐1王红艳1段文元3蔡春泉2△

(1复旦大学生命科学学院遗传学系上海200433;2天津市儿童医院外科天津300074;3济南军区总院心血管病研究所 济南250031)

目的通过研究丝氨酸羟甲基转移酶(serine hydroxy methyl transferase,SHMT1)基因启动子区的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)来探讨该基因与先天性心脏病 (congenital heart disease,CHD)的相关性。方法选取来自山东省的201例CHD患儿(病例组)和192例正常儿童(对照组),采用Sanger测序法对rs638416和rs117940726两个位点的基因分型进行病例-对照研究,进一步用双荧光素酶报告基因分析其是否为功能性SNP。结果两个SNP位点的基因型分布在病例组和对照组中均符合Hardy-Weinberg平衡;单位点分析显示rs638416位点G等位基因在病例组中分布频率显著高于对照组 (P=0.009)。经非条件Logistic回归分析确定,Log-additive模型最适用于分析rs638416,且该模型下统计学差异最显著 (OR=1.49,95%CI:1.11～ 2.01,P=0.007 4);双荧光素酶报告基因分析显示带有G等位基因的启动子序列转录效率较带有C等位基因的启动子序列低36% (P=0.013)。结论rs638416位点能影响SHMT1转录效率,并与心脏发育异常相关,提示rs638416位点G等位基因是山东人群CHD发生的遗传风险因子。

先天性心脏病;SHMT1;胸腺嘧啶合成;叶酸

先天性心脏病 (congenital heart disease,CHD)在所有出生缺陷中发生率最高,世界范围内新生儿的发生率接近1%[1]。目前在我国CHD总体发病率逐年升高,而且呈现南方高于北方、城市高于农村的特点,为提高国民出生人口素质,探索CHD致病机制已刻不容缓[2]。研究表明,环境因素和遗传因素与CHD的发生有关,该疾病的遗传度为55%～65%[3]。

叶酸是人体必需的营养元素,其作为一碳单位供体参与核苷酸合成以及甲基转移反应。女性孕期补充叶酸可以预防包括CHD在内的多种出生缺陷[4-6]。叶酸代谢途径中关键基因多态性与CHD的关联研究有助于揭示叶酸预防CHD发生的机制。

在叶酸通路中涉及叶酸中间代谢途径的多个基因已经被证明与CHD的发生有密切关系,但究竟是产生甲基化供体受阻,还是核苷酸从头合成受限的效应影响了心脏的早期发育,原因尚不明确[7-8]。本研究关注丝氨酸羟甲基转移酶基因(serine hydroxy methyl transferase,SHMT1)。研究证实,细胞质SHMT在脱氧胸苷酸的从头合成过程中起关键作用,该酶能够将丝氨酸上的一碳单位传递至亚甲基四氢叶酸上,后者作为一碳单位供体在胸苷酸合酶 (thymidylate synthase,TYMS)催化下将dUMP转化为dTMP[9-11]。亚甲基四氢叶酸除了向dUMP提供甲基外,同时也能提供甲硫氨酸合成所需的甲基,同位素示踪研究显示N5,N10-亚甲基四氢叶酸上的甲基主要用于合成dTMP[12]。SHMT1在参与叶酸代谢途径的基因中相对重要,许多涉及叶酸代谢的疾病关联研究将该基因纳入到候选基因中。以往针对SHMT1的研究主要集中在各类肿瘤和神经管畸形等,即使有针对CHD的研究因涉及叶酸代谢途径而将SHMT1基因纳入研究范围,也只是将常见的rs1979277 (C1420T)、rs12952556等几个位点作为标签SNP[13-15]。本研究选择了SHMT1启动子区的rs638416和rs117940726位点作为标签SNP,其中rs638416位点基因型为G/C,而rs117940726位点基因型为G/A。近年已有研究发现rs638416位点与某些疾病相关,而尚未见rs117940726位点与疾病相关的报道。

本研究试图通过探索dTMP从头合成途径的关键基因SHMT1与CHD的关联性来阐述CHD的部分致病机制,利用山东人群样本,以SHMT1基因启动子区rs638416和rs117940726为标签SNP位点进行病例-对照关联研究检测这些多态位点是否具有CHD易感性,同时分析这些SNP位点是否影响SHMT1基因表达。

资 料 和 方 法

病例和对照样本来源济南军区心血管专科医院在2009年6月至2012年6月期间收集来自山东地区的CHD病例201例和对照192例,并进行病理诊断。对照样本和病例样本年龄与性别尽量匹配,对照样本无CHD家族史。201例CHD病例中包含129例间隔缺损类CHD。本研究符合伦理学各项规定,经复旦大学伦理委员会批准,流行病调查资料收集及血样采集均经患儿监护人的知情同意。

SHMT1基因启动子区2个SNP位点分型

DNA提取 取外周血3 mL置于EDTA抗凝管中,冰箱保存;采用德国Qiagen公司血液基因组DNA提取试剂盒进行DNA的提取;抽提的DNA采用美国Thermo公司的Nanodrop 2000微量紫外分光光度计测定DNA浓度。

标签SNP选择参考千人基因组中国北京人群数据,挑选SHMT1起始密码子上游启动子区2.5 kbp范围内MAF>10%的2个SNP位点 (rs638416、rs117940726)纳入本文研究范围。

Sanger测序法分型针对两个SNP位点设计PCR扩增引物,引物由上海生工生物技术有限公司合成。使用日本Takara公司的Taq酶、dNTP及反应缓冲液,利用说明书提供的标准体系和扩增条件进行PCR。使用美国ABI公司的Bigdye试剂盒及3730测序仪针对PCR扩增产物进行标准化测序反应并检测。测序结果用Seqman软件读取并进行基因型统计。

双荧光素酶报告基因检测

报告基因载体构建使用美国Promega公司的PGL3 Basic质粒构建报告基因载体,利用标准的克隆步骤从基因组DNA中扩增出包含rs638416位点的DNA序列 (1.5 kbp)并构建到报告基因载体上。已构建成功的报告基因rs638416位点为G基因型,通过G>C的定点突变构建C基因型报告基因。

报告基因荧光信号检测报告基因检测基于293T细胞,按照标准的细胞培养流程及美国Promega公司双荧光素酶报告基因系统说明书进行实验操作。以PGL3报告基因载体/pRL-TK内参载体按10∶1的比例进行细胞共转染。利用美国Promega公司GloMax 96 微孔板发光检测仪检测G/A基因型的PGL3载体报告基因表达。

统计学分析通过χ2检验计算正常对照的Hardy-Weinberg平衡 (HWE)的理论值。通过Haploview软件对两个SNP位点进行连锁不平衡分析。相对OR和95%CI在校正年龄和性别之后由非条件Logistic回归模型计算获得。利用在线工具SNPstats的Codominant、Dominant、Recessive、Overdominant以及Log-additive 5种模型对SNP进行分析。采用SPSS 19.0软件进行统计分析,P<0.05为差异有统计学意义。

结　　　果

SHMT1基因启动子区SNP连锁不平衡分析软件计算结果显示,rs638416和rs117940726之间SHMT1基因启动子区的2个SNP位点不存在强连锁现象(图1)。

图1SHMT1基因启动子区SNP位点的连锁不平衡分析

Fig 1Linkage disequilibrium analysis of SNPs in the promoter region ofSHMT1

SHMT1基因启动子区单个位点SNP与CHD的关联分析SHMT1基因启动子区2个SNP位点rs638416和rs117940726的各基因型在对照组和病例组中的分布情况如表1所示。HWE检验结果显示,在对照组中rs638416和rs117940726的χ2检验P值分别为0.46和0.16,基因型分布符合遗传平衡。在经过年龄和性别因素校正后,根据遗传学模型进行Logistic回归分析,AIC和BIC值越小说明模型越精确。结果显示:除了Overdominant模型外,其余4种模型中rs638416位点都与CHD显著关联,且认为Log-additive模型最适用于分析该SNP位点 (表2);而在5组模型中均未观察到rs117940726位点与CHD的关联性 (表3)。

双荧光素酶报告基因检测 如图2所示,rs638416位点的G等位基因与C等位基因的报告基因相比荧光强度比值下降了36% (P=0.013)。

讨　　　论

为探索孕前补充叶酸干预CHD发生的机制,本研究选取叶酸代谢网络中与dTMP合成相关的关键酶SHMT1作为研究对象,在山东人群中通过选择SHMT1基因上游启动子区2个SNP进行病例-对照研究。结果显示rs638416位点与CHD有关,且通过双荧光素酶报告基因分析确定rs638416位点的G等位基因能够显著降低启动子的转录效率。本研究首次在人群中发现SHMT1与CHD的关联性,研究结果为“dTMP合成受阻是CHD病因之一”的观点提供了有力证据。

表1　在病例组和对照组中rs638416和rs117940726基因型的频率分布

表2　rs638416位点基因型分布的统计分析

AIC:Akaike′s information criterion;BIC:Bayes information criterion.

表3　rs117940726位点基因型分布的统计分析

AIC:Akaike′s information criterion;BIC:Bayes information criterion.

SHMT1是一个dTMP合成通路上游的限速酶,一旦SHMT1被破坏,dTMP合成效率大为降低。在SHMT1纯合敲除小鼠模型构建的研究中发现,虽有部分小鼠仍可无表型存活,但小鼠胚胎有较高的概率出现严重的神经管畸形表型,同时观察到由于dTMP的相对缺乏导致dUMP混入基因组序列中,此外SHMT1纯合敲除小鼠胚胎的体质量显著小于杂合敲除及野生型的胚胎[16]。小鼠模型显示了dTMP合成途径对于细胞乃至生物个体生长具有非常重要的作用,尤其是在胚胎和器官发育的早期阶段,然而在SHMT1敲除的小鼠中并未观察到心脏发育异常明显的表型,这也提示了人体心脏发育过程中可能对dTMP剂量需求更加敏感。

图2rs638416位点C等位基因与G等位基因的荧光素酶报告基因检测结果

Fig 2The luciferase reporter gene assays results of C allele and G allele of rs638416

本研究利用293T细胞验证rs638416位点对启动子效率的影响,而此前有研究在HepG2细胞中对rs638416位点开展双荧光素酶报告基因分析,两项研究得出的结论一致,G位点均可以降低启动子的转录效率[17]。我们推测rs638416位点所在区域可能是一个转录因子的结合位点,rs638416位点的G等位基因可能会破坏这个转录因子结合位点与转录因子的结合能力,从而降低启动子的转录效率。此前查证的文献中rs638416位点只与颞下颌关节紊乱、卵巢癌及肺癌的发生明确相关[18-20]。本研究解释了rs638416位点的部分机制,作为功能性SNP位点,其在今后有关叶酸代谢通路的研究中应更受关注。

叶酸在人体内的主要作用除了合成嘌呤及胸腺嘧啶外,同时也生成甲基化的S-腺苷甲硫氨酸。因此补充叶酸的作用主要是促进嘌呤、胸腺嘧啶及S-腺苷甲硫氨酸的合成。本课题组此前进行的一项针对合成胸腺嘧啶的关键基因TYMS多态性与CHD的关联研究未发现TYMS与CHD有关联性[10]。我们认为前期研究结果与本研究结论并不矛盾:TYMS是从dUMP合成dTMP的唯一酶,因而在进化角度上必须非常保守,影响酶活性的变异均可能被淘汰,该证据显示了胸腺嘧啶合成通路的重要性。生物体演化出SHMT1及SHMT2这两个同源酶来共同催化产生N5,N10-亚甲基四氢叶酸,此外四氢叶酸也可以被催化为N5,N10-亚甲基四氢叶酸,此种多重补偿机制同样体现了dTMP合成通路的重要性。我们推测在心脏发育早期,细胞增殖对N5,N10-亚甲基四氢叶酸剂量非常敏感,一旦N5,N10-亚甲基四氢叶酸剂量不足引发胸腺嘧啶合成受阻,很可能诱发CHD。

本研究结果在遗传学的层面上揭示了叶酸对预防CHD的部分机制,而针对dTMP合成通路与CHD病的关系需要进一步在不同人群中进行验证并开展相关功能研究,以完善对dTMP合成通路参与CHD发生机制的认识。

[1]VAN DER LINDE D,KONINGS EE,SLAGER MA,etal.Birth prevalence of congenital heart disease worldwide:a systematic review and meta-analysis[J].JAmCollCardiol,2011,58 (21):2241-2247.

[2]朱军,周光萱,代礼,等.1996～2000年全国围产期先天性心脏病发生率的分析[J].四川大学学报(医学版),2005,35 (6):875-877.

[3]VAN DER BOM T,ZOMER AC,ZWINDERMAN AH,etal.The changing epidemiology of congenital heart disease[J].NatRevCardiol,2011,8 (1):50-60.

[4]BAILEY LB,BERRY RJ.Folic acid supplementation and the occurrence of congenital heart defects,orofacial clefts,multiple births,and miscarriage[J].AmJClinNutr,2005,81 (5):1213S-1217S.

[5]HERNANDEZ-DIAZ S,WERLER MM,WALKER AM,etal.Folic acid antagonists during pregnancy and the risk of birth defects[J].NEnglJMed,2000,343 (22):1608-1614.

[6]IOoNESCU-ITTU R,MARELLI AJ,MACKIE AS,etal.Prevalence of severe congenital heart disease after folic acid fortification of grain products:time trend analysis in Quebec,Canada[J].BMJ,2009,338:b1673.

[7]ZHAO J,YANG XY,GONG XH,etal.Functional variant in methionine synthase reductase intron-1 significantly increases the risk of congenital heart disease in the Han Chinese population[J].Circulation,2012,125 (3):482-490.

[8]ZHAO JY,QIAO B,DUAN WY,etal.Genetic variants reducing MTR gene expression increase the risk of congenital heart disease in Han Chinese populations[J].EurHeartJ,2014,35 (11):733-742.

[9]LEDUC D,GRAZIANI S,MESLET-CLADIERE L,etal.Two distinct pathways for thymidylate (dTMP) synthesis in (hyper) thermophilic Bacteria and Archaea[J].BiochemSocTrans,2004,32 (Pt 2):231-235.

[10]ZHAO JY,SUN JW,GU ZY,etal.Genetic polymorphisms of the TYMS gene are not associated with congenital cardiac septal defects in a Han Chinese population[J].PLoSOne,2012,7 (2):e31644.

[11]ERMENS AA,SCHOESTER M,LINDEMANS J,etal.Effect of nitrous oxide on folate coenzyme distribution and de novo synthesis of thymidylate in human bone marrow cells[J].ToxicolInVitro,1992,6 (2):133-137.

[12]HERBIG K,CHIANG EP,LEE LR,etal.Cytoplasmic serine hydroxy methyl transferase mediates competition between folate-dependent deoxyribonucleotide and S-adenosylmethionine biosyntheses[J].JBiolChem,2002,277 (41):38381-3839.

[13]PANDEY S,GARG P,LEE S,etal.Nucleotide biosynthesis arrest by silencing SHMT1 function via vitamin B6-coupled vector and effects on tumor growth inhibition[J].Biomaterials,2014,35 (34):9332-9342.

[14]LI L,JIN C,ZHENG Q,etal.Polymorphism of cytosolic serine hydroxy methyl transferase and breast cancer risk:evidence from a meta-analysis[J].TumourBiol,2014,35 (8):7361-7367.

[15]BEAUDIN AE,ABARINOV EV,MALYSHEVA O,etal.Dietary folate,but not choline,modifies neural tube defect risk in Shmt1 knockout mice[J].AmJClinNutr,2012,95 (1):109-114.

[16]BEAUDIN AE,ABARINOV EV,NODEN DM,etal.Shmt1 and de novo thymidylate biosynthesis underlie folate-responsive neural tube defects in mice[J].AmJClinNutrition,2011,93 (4):789-798.

[17]HEBBRING SJ,CHAI Y,JI Y,etal.Serine hydroxy methyl transferase 1 and 2:gene sequence variation and functional genomic characterization[J].JNeurochem,2012,120 (6):881-890.

[18]WANG L,LU J,AN J,etal.Polymorphisms of cytosolic serine hydroxy methyl transferase and risk of lung cancer:a case-control analysis[J].LungCancer,2007,57 (2):143-151.

[19]KELEMEN LE,SELLERS TA,SCHILDKRAUT JM,etal.Genetic variation in the one-carbon transfer pathway and ovarian cancer risk[J].CancerRes,2008,68 (7):2498-2506.

[20]ANEIROS-GUERRERO A,LENDINEZ AM,PALOMARES AR,etal.Genetic polymorphisms in folate pathway enzymes,DRD4 and GSTM1 are related to temporomandibular disorder[J].BMCMedGenet,2011,12:75.

E-mail:tjpns@126.com

Association of rs638416 in SHMT1 promoter and congenital heart diseases

JIANG Yu-chao1, KUANG Le-le1, WANG Hong-yan1, DUAN Wen-yuan3, CAI Chun-quan2△

(1DepartmentofGenetics,SchoolofLifeSciences,FudanUniversity,Shanghai200433,China;2DepartmentofSurgery,Children′sHospital,Tianjing300074,China;3InstituteofCardiovascularDissease,GeneralHospitalofJinanMilitaryRegion,Jinan250031,China)

ObjectiveTo explore the association between single nucleotide polymorphism (SNPs) in the promoter region of cytoplasmic serine hydroxy methyl transferase (SHMT1) and congenital heart disease (CHD).MethodsWe performed a case-control study including 201 CHD patients and 192 control participants from Shandong province,China through Sanger sequencing of rs638416 and rs117940726.Then we conducted luciferase reporter gene assays to confirm if they were functional SNP.ResultsThese two SNPs were genotyped and they were in Hardy-Weinberg equilibrium both in control and case groups.The single locus analysis revealed the genotype distribution of rs638416 was significant different between case patients and control subjects (P=0.009).In the unconditional Logistic regression analysis,Log-additive model was the most suitable model to analysis rs638416,and in this model association data showed the most significant statistical different (OR=1.49,95%CI:1.11-2.01,P=0.007 4).The result of luciferase reporter gene assays also showed 36% transcription activity reduction (P=0.0013) of the promoter region containing G allele when compared to the promoter region containing G allele.ConclusionsWe confirmed rs638416 reduced the transcription activity ofSHMT1 and may involve with abnormal heart development.The G allele of rs638416 is a genetic risk factor of CHD in Shandong population.

congenital heart diseases;SHMT1;purine de novo synthesis;folic acid

Q39, R725.4

Adoi: 10.3969/j.issn.1672-8467.2016.04.008

2015-07-28;编辑:段佳)

天津市卫生行业重点攻关项目 (12KG116);天津市自然科学基金 (14JCYBJC25000)

*This work was supported by the Key Project of Tianjin Health Care Professionals (12KG116) and the Natural Science Foundation of Tianjin City,China (14JCYBJC25000).