替米沙坦联合氨氯地平对血管紧张素Ⅱ诱导乳鼠心肌成纤维细胞增殖的影响

马香芹，陈洁，赵汴霞，赵娜，杨红梅

替米沙坦联合氨氯地平对血管紧张素Ⅱ诱导乳鼠心肌成纤维细胞增殖的影响

马香芹1，陈洁1，赵汴霞1，赵娜1，杨红梅1

目的分析替米沙坦联合氨氯地平对血管紧张素Ⅱ（Ang Ⅱ）诱导的乳鼠心肌成纤维细胞增殖的影响以及相关机制。方法新生1～3 d Wistar 大鼠30只，雌雄不拘，培养原代心肌细胞，采用差速贴壁获得心肌成纤维细胞，传代培养。取对数期成纤维细胞，分组并给予处理，对照组：加入15%胎牛血清DEME培养液，Ang Ⅱ组：15%胎牛血清DEME培养液+Ang Ⅱ，替米沙坦组：在Ang Ⅱ组基础上加入替米沙坦，氨氯地平组：在Ang Ⅱ组基础上加入氨氯地平，联合组：在Ang Ⅱ组基础上加入替米沙坦+氨氯地平。鉴定成纤维细胞。CCK-8法检测各组细胞增殖情况，应用免疫组化染色测定血凝素样氧化低密度脂蛋白受体-1（LOX-1）及肿瘤坏死因子-α（TNF-α）蛋白水平，应用RT-PCR法测定LOX-1及TNF-α mRNA表达水平。结果心肌成纤维细胞胞体较大，胞浆透明，细胞呈梭形，细胞核呈椭圆形，通常含2～3个核，细胞纯度高达98%。与对照组相比，Ang Ⅱ组增殖活性升高，而加入替米沙坦和氨氯地平后，抑制Ang Ⅱ诱导的增殖，联合应用替米沙坦和氨氯地平较单药抑制作用更明显，差异有统计学意义（P均＜0.05）。与对照组相比，Ang Ⅱ组心肌成纤维细胞TNF-α及LOX-1 mRNA表达水平显著升高，差异有统计学意义（P均＜0.05）。各药物干预组与Ang Ⅱ组相比，TNF-α及LOX-1 mRNA表达水平显著降低，其中联合组下降最明显，差异有统计学意义（P均＜0.05）。与对照组相比，Ang Ⅱ组心肌成纤维细胞TNF-α及LOX-1 蛋白表达水平显著升高，差异有统计学意义（P均＜0.05）。各药物干预组与AngⅡ组相比，TNF-α及LOX-1蛋白表达水平显著降低，联合组较替米沙坦组和氨氯地平组两种蛋白的表达降低，差异有统计学意义（P均＜0.05）。结论替米沙坦联合氨氯地平能有效抑制Ang Ⅱ诱导的心肌成纤维细胞增殖，其可能机制为抑制LOX-1及TNF-α过度表达。

替米沙坦；氨氯地平；血管紧张素Ⅱ；成纤维细胞；血凝素样氧化低密度蛋白受体-1

成纤维细胞活化及增生是心肌纤维化的重要因素。血管紧张素Ⅱ（Ang Ⅱ）可诱导成纤维细胞增殖，介导心肌纤维化［1］。氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）可与血凝素样氧化低密度脂蛋白受体-1（LOX-1）结合并介导动脉粥样斑块形成及发展［2］。另外，LOX-1还与心室重构、心肌肥大及心力衰竭有密切的关系。肿瘤坏死因子-α（TNF-α）经细胞实验证实，可促进心肌细胞肥大、诱导心肌细胞凋亡并介导心肌纤维化［3］。替米沙坦属于Ang Ⅱ受体拮抗剂，能有效预防心肌纤维化，氨氯地平属于长效降压药，可有效舒张血管，改善心肌供血并抑制心肌纤维化［4］。本研究观察了替米沙坦联合氨氯地平对Ang Ⅱ诱导的乳鼠心肌成纤维细胞增殖及LOX-1、TNF-α表达的影响，旨在探讨替米沙坦联合氨氯地平对心肌成纤维细胞的作用及可能机制。

1　材料与方法

1.1实验动物和试剂新生1～3 d Wistar大鼠30只，雌雄不拘，由河南省实验动物中心提供。新生胎牛血清（北京雅安达生物技术有限公司）、DEME培养液（美国Sigma公司）、Ang Ⅱ试剂（北京方程生物科技有限公司）、胰蛋白酶消化液（北京索莱宝科技有限公司）、TNF-α多克隆抗体（美国Sigma公司）、MM-MLV反转录酶（美国Sigma公司）、LOX-1抗体（美国Gibco公司）。替米沙坦（北京万生药业有限责任公司，批号：H201502036）、氨氯地平（苏州第壹制药有限公司，批号：H201509123）。

1.2实验仪器CO2培养箱（型号：MCO-20AIC，德国Heraeus公司）、电子天平（BP211D型，Sartorius公司）、紫外投射仪（苏州电子仪器有限公司）、凝胶密度扫描成像系统（上海天能科技有限公司）、水平凝胶电泳槽（德国Eppendorf公司）、光学显微镜（型号：DMLP-MP30，日本RICOH公司）、微量移液器（20 μl、200 μl、1000 μl）购自Dragon Med公司、台式微量离心机（型号：H1650-W，美国Sigma公司）、高速冷冻离心机（型号：A1330103，美国Beckman公司）、台式低温高速离心机（型号：TD-35M/TD35，德国Hettich公司）。

1.3方法

1.3.1心肌成纤维细胞培养在无菌条件下取30只Wistar乳鼠，将其左心室取出并剪碎成1 mm3大小，PBS缓冲液反复冲洗3次，依次加入0.01% Ⅱ型胶原酶、0.08%胰蛋白酶消化10 min，反复消化直至组织块消失。收集悬浮液离心过滤后留取沉淀物，并置于37℃ CO2培养箱中恒温培养。由于成纤维细胞与心室肌细胞生长时间不同，采用差速贴壁2 h获得心肌成纤维细胞，待细胞生长至满瓶后应用0.25%胰蛋白酶消化传代培养，培养2～3代后收集成纤维细胞。

1.3.2心肌成纤维细胞鉴定将传代成纤维细胞接种至玻片上，待细胞爬满玻片后，将玻片取出，PBS缓冲液冲洗3遍，室温下加入4%多聚甲醛固定，于恒温水浴箱中孵育30 min，采用血清封闭，室温下以1：50加入鼠抗波形蛋白单克隆抗体工作液恒温孵育3 h，依次加入生物素标记山羊抗小鼠免疫球蛋白及辣根酶标记链酶卵白素工作液于室温孵育。应用二氨基联苯胺（DAB）显色剂显色，PBS缓冲液冲洗，苏木素复染，酒精梯度脱水，中性树脂封固，并于倒置显微镜下观察。

1.3.3分组及药物处理对照组：加入15%胎牛血清DEME培养液，Ang Ⅱ组：15%胎牛血清DEME培养液+1×10-6mol/L Ang Ⅱ，替米沙坦组：在Ang Ⅱ组基础上加入替米沙坦，终浓度为10 μmol/L，氨氯地平组：在Ang Ⅱ组基础上加入氨氯地平，终浓度为1 μmol/L，联合组：在Ang Ⅱ组基础上加入替米沙坦（终浓度10 μmol/L）+氨氯地平（终浓度1 μmol/L）。

1.4CCK-8检测心肌成纤维细胞增殖将心肌成纤维细胞接种于96孔板，每组设置6个孔。待细胞贴壁生长后，药物处理各组细胞，培养48 h，吸去上清液，各孔加入10% CC-K 20 μl，于培养箱孵育2.5 h后应用酶标仪测定450 nm处吸光度（OD）值。

1.5RT-PCR扩增目的基因乳鼠LOX-1基因序列以β-actin为内参，TNF-α基因以GAPDH为内参，引物序列由上海生物工程有限公司合成（表1）。药物干预48 h后，TRIzol试剂一步法提取心肌成纤维细胞总RNA，经PCR分析仪检测，LOX-1、TNF-α目的基因OD值为1.8～2.0，符合实验要求。采用PCR试剂盒合成cDNA，再取逆转录产物1 μl行PCR扩增，LOX-1反应条件：95℃预变性3 min，95℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸60 s，经38个循环后再延伸5 min。TNF-α反应条件：94℃预变性3 min，94℃变性30 s，59℃退火30 s，72℃延伸60 s，35个循环后72℃再延伸7 min。产物经2%琼脂糖凝胶电泳分析，mRNA表达量=目的基因吸光度/内渗β-actin吸光度。

1.6免疫组化染色药物处理细胞48 h后，制作细胞涂片。3% H2O2孵育5～10 min，PBS洗3次，每次5min；10%山羊血清封闭，室温孵育10 min。去除血清，勿洗，滴加适当比例稀释的一抗（山羊抗鼠LOX-1多克隆抗体1：100，山羊抗鼠TNF-α多克隆抗体1：50），4℃湿盒过夜，PBS洗3次，每次5 min。滴加辣根酶标记的二抗（1：100），37 ℃孵育30 min，PBS洗3次，每次5 min。DAB显色，PBS洗3次，每次5 min。自来水冲洗，复染，封片。采用Biosins 数码成像系统分析染色区域积分光密度值。

表1　各引物序列、产物大小及退火温度

1.7统计学分析应用SPSS 19.0统计学软件进行数据处理，计量资料采用均数±标准差（±s）表示，多组间均数的比较采用方差分析，两两比较采用LST-D法分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1心肌成纤维细胞鉴定倒置显微镜下可见心室肌细胞在未贴壁时呈圆形，贴壁后，生长逐渐呈梭形、多角形，胞核1～2个、呈圆形，细胞大小均匀，细胞有伪足伸出，变为多边形（图1A）。而心肌成纤维细胞胞体较大，胞浆透明，细胞呈梭形，细胞核呈椭圆形，通常含2～3个核，细胞核内出现棕黄色颗粒，细胞纯度高达98%（图1B）。

图1　心肌成纤维细胞鉴定（×200）（1A为心室肌细胞，1B为心肌成纤维细胞）

2.2各组心肌成纤维细胞增殖情况与对照组相比，Ang Ⅱ组增殖活性升高，而加入替米沙坦和氨氯地平后，抑制Ang Ⅱ诱导的增殖，联合应用替米沙坦和氨氯地平较单药抑制作用更明显，差异有统计学意义（P均＜0.05）（表2）。

2.3各组心肌成纤维细胞TNF-α与LOX-1 mRNA表达水平比较与对照组相比，Ang Ⅱ组心肌成纤维细胞TNF-α及LOX-1 mRNA表达水平显著升高，差异有统计学意义（P均＜0.05）。各药物干预组与Ang Ⅱ组相比，TNF-α及LOX-1 mRNA表达水平显著降低，其中联合组下降最明显，差异有统计学意义（P均＜0.05）（表3）。

2.4各组LOX-1、TNF-α免疫组化染色结果对照组心肌成纤维细胞LOX-1、TNF-α染色呈阴性；Ang Ⅱ组细胞质中有明显的棕色颗粒，呈阳性。与对照组相比，Ang Ⅱ组心肌成纤维细胞TNF-α及LOX-1蛋白表达水平显著升高，差异有统计学意义（P均＜0.05）。各药物干预组与AngⅡ组相比，TNF-α及LOX-1蛋白表达水平显著降低，联合组较替米沙坦组和氨氯地平组两种蛋白的表达降低，差异有统计学意义（P均＜0.05）（表4、图2、图3）。

表2　各组心肌成纤维细胞增殖情况（n=6）

（1为对照组，2为Ang Ⅱ组，3为替米沙坦组，4为氨氯地平组，5为联合组）

表3　各组心肌成纤维细胞TNF-α 与LOX-1相对表达情况（n=6）

3　讨论

一些血管活性物质及促纤维化因子可激活多种细胞信号通路，引起胶原蛋白沉积，增加心室肌僵硬度［5］。有效抑制心肌成纤维细胞过度增殖对保护心脏功能具有重要的作用。Ang Ⅱ具有收缩血管作用，与其受体结合通过酪氨酸激酶途径激活丝裂霉素活化蛋白酶，从而促进及介导心肌成纤维细胞增殖及转化，在心脏病终末期病变中起到重要作用［6，7］。替米沙坦作为新一代非肽类Ang Ⅱ受体拮抗剂，阻断肾素-血管紧张素-醛固酮系统（RAS），抑制Ang Ⅱ分泌［8］。Liu等［9］研究认为，替米沙坦能有效降低心肌病大鼠炎症水平及心肌蛋白的表达，抑制心肌纤维化。氯氨地平属于钙离子通道阻滞剂，能有效改善心肌供血，降低心脏压力负荷，抑制心肌胶原蛋白生成，进而抑制心肌纤维化［10，11］。

表4　各组LOX-1、TNF-α免疫组化染色统计结果（n=6）

图2　各组TNF-α免疫组化染色结果（×400）（A为对照组，B为Ang Ⅱ组，C为替米沙坦组，D为氨氯地平组，E为联合组）

图3　各组LOX-1免疫组化染色结果（×400）（A为对照组，B为AngⅡ组，C为替米沙坦组，D为氨氯地平组，E为联合组）

本研究发现Ang Ⅱ促进心肌成纤维细胞的增殖，结果与既往研究［12］一致。与Ang Ⅱ组相比，各药物干预组抑制心肌成纤维细胞增殖，替米沙坦联合氨氯地平抑制更明显。TNF-α诱导心肌细胞凋亡。本研究应用免疫组化法测定各组TNF-α和LOX-1的表达情况，结果显示，对照组呈阴性，Ang Ⅱ组呈阳性，替米沙坦组、氨氯地平组及联合组染色呈弱阳性。RT-PCR检测mRNA的表达情况，结果显示与免疫组化染色结果一致。提示，Ang Ⅱ可上调LOX-1和TNF-α表达，替米沙坦联合氨氯地平可明显抑制Ang Ⅱ诱导的表达上调。

综上所述，替米沙坦联合氨氯地平能有效抑制Ang Ⅱ诱导的心肌成纤维细胞增殖，其可能机制与抑制LOX-1及TNF-α蛋白过度表达有关。

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本文编辑：姚雪莉

Effect of telmisartan and amlodipine on myocardial fibroblasts proliferation of neonatal rats inducedby angiotensin Ⅱ

MA Xiang-qin*， CHEN Jie， ZHAO Bian-xia， ZHAO Na， YANG Hong-mei.*Henan medical college， Zhengzhou Henan， 451191， China.

YANG Hong-mei； E-mail: yyd19982@163.com

Objective To investigate the combination impact of telmisartan and amlodipine on proliferation of neonatal rat cardiac fibroblasts induced by angiotensin Ⅱ （Ang Ⅱ）. Methods Primary cardiac fibroblasts were isolated from 30 Wistar neonatal rats and continuously cultured. Cell cultures were divided into five groups and treated with different drugs： control group （cultured with DEME plus 15% fetal bovine serum）， Ang Ⅱ group （control medium supplemented with 1×10-6mol/L Ang Ⅱ）， telmisartan group （TE group， addition of 10 μmol/L telmisartan on the basis of Ang Ⅱ group）， amlodipine group （AM group， addition of 1 μmol/L amlodipine on the basis of Ang II group），and telmisartan + amlodipine group （TE + AM group， addition of 10 μmol/L telmisartan and 1 μmol/L amlodipine on the basis of Ang Ⅱ group）. The cell proliferation of cardiac fibroblasts was measured by CCK8 method. The protein level of lectin-like oxidized low-density lipoprotein receptor-1 （LOX-1） and tumor necrosis factor α （TNF-α）was determined by immunohistochemical staining. The mRNA level of LOX-1 and TNF-α was detected by RTPCR. Results Cardiac fibroblasts were large and spindle with transparent cytoplasm including 2-3 nucleuses in elliptical shape. The purity was 98%. Compared with the control group， the protein level and mRNA level of LOX-1 and TNF-α were significantly increased in the Ang Ⅱ group （P<0.05）. Compared with the Ang II group， the protein level and mRNA level of LOX-1 and TNF-α were significantly reduced in telmisartan group and amlodipine group（P<0.05）. Compared with telmisartan group and amlodipine group， the protein level and mRNA level of LOX-1 and TNF-α were further reduced in the combination drug group （P<0.05）. Conclusion The induced proliferation of cardiac fibroblasts by Ang II could be inhibited by telmisartan and amlodipine. The combination uses of two drugs yielded more obvious reduction. The possible mechanism might be due to inhibiting the over-expression of LOX-1 and TNF-α.

Telmisartan； Amlodipine； Angiotensin Ⅱ； Cardiac fibroblasts； Lectin-like oxidized LDL receptor-1 protein

R544.1

A

1674-4055（2016）08-0928-04

河南省二O一四年基础与前沿技术研究计划项目（142300410467）

1 451191郑州，河南医学高等专科学校

杨红梅，E-mail：yyd19982@163.com

10.3969/j.issn.1674-4055.2016.08.10