小分子抑制剂VLT对乳腺癌细胞生长的影响

关　瑜　周翔宇　陈　垚

(吉林省食品药品安全监测中心，吉林　长春　130000)



小分子抑制剂VLT对乳腺癌细胞生长的影响

关瑜周翔宇1陈垚

(吉林省食品药品安全监测中心，吉林长春130000)

目的研究小分子抑制剂VLT对乳腺癌细胞生长的影响。方法采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测乳腺癌细胞在不同时间段(12、48、72 h)的细胞增殖活性；流式细胞仪检测乳腺癌细胞周期及细胞凋亡率的变化。结果小分子抑制剂VLT对乳腺癌细胞具有明显的抑制作用，并在48 h作用最为明显；VLT 2 000 μg/ml组与正常对照组及VLT 1 000 μg/ml组比较显著差异(P<0.05)；G0/G1期细胞显著升高，S 期细胞数减少；细胞凋亡率明显增加,VLT 2 000 μg/ml组分别与空白对照及VLT 1 000 μg/ml组比较均差异显著(P<0.05)。结论小分子抑制剂VLT可能通过细胞周期的改变，抑制肿瘤细胞增殖，发挥抗肿瘤生长作用。

小分子抑制剂VLT；乳腺癌

乳腺癌的发病原因包括遗传性疾病、生活方式或饮食因素。其传统的治疗原则是术后先放疗后化疗或单独放疗/化疗，但都难以提高其临床疗效〔1〕，目前国内外已研究的抗肿瘤药物众多，但多数价格昂贵且不良反应大。同时也存在耐药性问题，使其临床应用受到一定限制〔2～4〕，本实验旨在研究小分子抑制剂VLT对乳腺癌细胞生长的影响。

1　材料与方法

1.1细胞、主要试剂及药品 乳腺癌细胞株：购自中国科学院上海细胞生物学研究所。主要试剂：(1)细胞周期与细胞凋亡检测试剂盒(产品编号：C1052)由江苏碧云天生物技术研究所产品；(2)二甲基亚砜、四甲基偶氮唑蓝 (MTT)，美国Sigma 公司产品；(3)小分子抑制剂VLT由上海吉尔公司合成，纯度为98%；(4)多西他赛由海正辉瑞制药有限公司生产，国药准字H20093520。

1.2主要仪器(1)倒置显微镜 NiKon ECLIPSE 80i (日本尼康公司)；(2)二氧化碳培养箱(日本三样电机株式会社制造 产品型号：NCO-15AC)；(3)AN YANG 超净台 (中国苏州安洋科技发展有限公司，型号：BSC-BOOⅡB2)；(4)流式细胞仪(美国becton-Dickson公司)；(5)酶标仪(中国上海BIO-RAD公司，MODEL550型)

1.3方法(1)MTT法检测细胞存活率:取对数生长期乳腺癌细胞，常规胰酶消化，计数，以每孔1×104/ml接种于96孔板中，100 μl/孔，终体积为200 μl，37℃、5%CO2孵育箱培养4 h，待细胞贴壁后，随机分为空白对照组、多西他赛(100 μg/ml)组及不同浓度VLT(1 000、1 500、2 000 μg/ml)组，20 μl/孔，空白对照组加入等体积的培养液，每组分别设5个复孔。置入37℃、5%CO2培养，分别孵育24、48、72 h，每孔加入20 μl MTT孵育4 h，以二甲基亚砜(DMSO)每孔150 μl终止反应。将96孔板移入平板振荡器，水平振荡10 min。用酶联免疫检测仪于490 nm波长测定吸光度(A)值，以空白对照孔A值凋零，记录结果。(2)流式细胞术检测细胞周期:取对数生长期乳腺癌细胞，常规胰酶消化，计数，以每孔1×106/ml接种6孔板中，分组及给药浓度方法同上，在培养48 h后，收集细胞，加入冰冷的磷酸盐缓冲液(PBS)将细胞轻轻吹打成单个细胞，离心，PBS洗2次，用500 μl PBS从悬细胞，每离心管中加入各100 μl〔1 mg/ml碘化吡啶(PI)、10 mg/ml RNaseA、0.01%Triton-X100〕，37℃避光染色30 min。采用流式细胞仪测定细胞周期变化，结果以各个细胞周期所占的百分率表示。(3)Annexin V-FITC/PI 法分析细胞凋亡:取对数生长期乳腺癌细胞，常规胰酶消化，计数，以每孔5×105/ml接种6孔板中，分组及给药浓度方法同上，在培养48 h后，收集细胞，并用冰冷的PBS洗涤，加入195 μl Annexin V-FITC结合液轻轻重悬细胞，室温(20℃～25℃)避光孵育10 min，加入10 μl PI染色液，轻轻混匀冰浴，避光放置，采用流式细胞仪进行检测。

1.4统计学分析采用SPSS13.0软件进行t检验。

2　结　果

2.1MTT法检测细胞活性如表1所示，不同剂量小分子抑制剂-VLT作用于乳腺癌细胞在24 h时，各实验组比较无显著差异(P>0.05)。在48 h，VLT 2 000 μg/ml组与正常对照组及VLT 1 000 μg/ml组比较显著差异(P<0.05)，VLT 2 000 μg/ml组与多西他赛组比较无显著差异(P>0.05)；在72 h时,各实验组比较无统计学意义(P>0.05)。

表1　VLT对乳腺癌细胞增殖活性的影响值)

与VLT 2 000 μg/ml组比较：1)P<0.05；下表同

2.2小分子抑制剂-VLT对乳腺癌细胞周期和凋亡率检测在48 h，VLT能够引起乳腺癌细胞周期发生改变，VLT 2 000 μg/ml组G0/G1期比例明显升高，S期细胞数明显减少，细胞凋亡率明显增加，分别与空白对照组及VLT 1 000 μl/ml组比较差异显著(P<0.05)，VLT 2 000 μl/ml组与多西他赛组比较无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2　VLT对乳腺癌细胞周期及凋亡的影响

3　讨　论

近年来，乳腺癌发病年龄有逐渐年轻化的趋势〔5〕，由于发病机制目前仍不清楚，其治疗一直没有重大突破。目前主要通过手术治疗，并联合化疗、放疗减少肿瘤的复发及转移，但其治愈率仍较低。

有研究报道，肿瘤的发生是多途径、多步骤的，还与细胞凋亡有关，细胞增殖与凋亡之间的平衡失调与肿瘤的发生、发展密切相关。因此，抑制肿瘤细胞增殖，诱导其凋亡已成为肿瘤治疗的重要手段之一〔6～8〕。本实验表明小分子抑制剂VLT 2 000 μg/ml组细胞生长具有明显抑制作用。

研究表明，细胞癌变与细胞周期密切相关。多种抗肿瘤药物对细胞周期有特异的阻滞作用，导致肿瘤细胞停滞在G2/M期而发挥治疗作用〔9,10〕。流式细胞术检测细胞凋亡水平具有直观、准确等优点〔11〕。本研究结果推测小分子抑制剂-VLT对乳腺癌细胞生长是通过阻滞G0/G1期细胞，使S期细胞减少，诱导细胞凋亡。

1Zhao JX,Liu XQ,Dong BJ.Primary study of bevacizumab combined with temozolomide for recurrent glioma〔J〕.Chin Clin Oncol,2011;16(10):920-2.

2Okada M,Sato A,Shibuya K.JNK contributes to temozolomide resistance of stem-like glioblastoma cells via regulation of MGMT expression〔J〕.Int J Oncol,2014;44(2):591-9.

3Sze CI,Su WP,Chiang MF,etal.Assessing current therapeutic approaches to decode potential resistance mechanisms in glioblastomas〔J〕.Front Oncol,2013;3:59.

4Silber JR,Bobola MS,Blank A,etal.O(6)-methylguanine- DNA methyltransferase in glioma therapy:promise and problems〔J〕.Biochim Biophys Acta,2012;1826(1):71-82.

5Ratchanon S,Phaloprakarn C,Traipak K.Pain control in laparoscopic gynecologic surgery with/without preoperative parecoxib sodium injection:a randomized study〔J〕.J Med Assoc Thai,2011;94(10):1164-8.

6方艳秋，齐亚灵，白晓，等.Survivin反义核苷酸对肝细胞株SMMC-7721增殖的影响〔J〕.吉林大学学报：医学版，2013;39(2):278-81.

7Cobbs CS.Cytomegalovirus and brain tumor:epidemiology,biology and therapeutic aspects〔J〕.Curr Opin Oncol,2013;25(6):682-8.

8Dubrez L,Berthelet J,Glorian V.IAP proteins as targets for drug development in oncology 〔J〕.Oncol Targets Ther,2013;9:1285-304.

9Stuckey DW,Shan K.TRAIL on trail:preclinical advances in cancer therapy〔J〕.Trends Mol Med,2013;26(13):154-8.

10Fink MY,Chipuk JE.Survival of HER2-positive breast cancer cells:receptor signaling to apoptotic control center〔J〕.Genes Cancer,2013;4(5/6):187-95.

11Dabbagh A,Rajaei S.The role of anesthetic drugs in liver apoptosis〔J〕.Hepat Mon,2013;13(8):e13162.

〔2016-03-22修回〕

(编辑李相军/滕欣航)

陈垚(1964-),女，主任药师，主要从事药品安全性评价研究。

关瑜(1983-),女，主管药师，主要从事药品安全性评价研究。

R73

A

1005-9202(2016)15-3636-02；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.15.011

1吉林大学中日联谊医院肝胆胰外科