白细胞介素-17在卵清蛋白诱导的大鼠过敏性结膜炎发病中的作用

张　剑　王玉清　宿星杰　刘宏伟

(佳木斯大学附属第一医院眼科，黑龙江　佳木斯　154002)



白细胞介素-17在卵清蛋白诱导的大鼠过敏性结膜炎发病中的作用

张剑王玉清宿星杰刘宏伟

(佳木斯大学附属第一医院眼科，黑龙江佳木斯154002)

目的探讨白细胞介素(IL)-17在鸡卵清蛋白(OVA)诱导的大鼠过敏性结膜炎(AC)发病中的可能作用。方法30只Brown Norway大鼠随机分对照组(NC组)和AC组。应用OVA诱导大鼠AC模型。观察两组眼睑和结膜充血、水肿、分泌物情况并做评分。对两组眼球和上下眼睑进行病理学分析,计数穹隆部眼结膜嗜酸性粒细胞浸润数。应用酶联免疫吸附(ELISA)法测定大鼠血清和脾细胞培养上清液IL-17、IL-4、IL-6、IL-10、干扰素(IFN)-γ水平。结果AC组体征评分明显高于NC组(P<0.01)。AC组眼结膜穹隆部嗜酸性粒细胞计数较NC组明显升高(P<0.01)。AC组血清和脾细胞培养上清液IL-17、IL-4、IL-6、IL-10水平较NC组明显升高(均P<0.01)，IFN-γ水平明显降低(P<0.01)。结论IL-17 增高、Th1/Th2失衡是大鼠AC发病的重要原因，降低IL-17、恢复Th1/Th2失衡可能成为AC治疗的一条新途径。

过敏性结膜炎；T细胞；白细胞介素-17

有报道全世界患过敏性结膜炎(AC)者达20%，我国患病率约10%～16%〔1,2〕。研究表明AC是眼部结膜对外源特异性抗原发生的免疫应答，包括IgE介导的Ⅰ型变态反应和T 细胞介导的免疫反应〔3〕。近年研究发现机体T 细胞前体Th0能分化产生一种新型的17型辅助性T细胞，它不同于1型和2型T细胞，有独特的分化和发育调节机制，能产生特异性的效应因子白细胞介素(IL)-17，IL-17能强大招募中性粒细胞，促进多种细胞分泌释放炎性因子，放大炎症反应，参与多种免疫性炎症疾病的病理过程〔4〕。本实验探讨IL-17在卵清蛋白(OVA)致敏的大鼠AC发病中的可能作用。

1　材料与方法

1.1实验动物及分组由佳木斯大学实验动物中心提供的SPF级，鼠龄6～8 w，Brown Norway大鼠30只，体重150～200 g，按随机数字法分为对照组(NC组)10只，AC组20只。

1.2主要试剂及仪器OVA、Al(OH)3(美国Sigma公司)，Giemsa染色试剂(北京索莱宝科技有限公司)，台吩蓝(上海生工生物工程股份有限公司)，RPMI1640培养基(美国Gibco公司)，大鼠变应原特异性IL-17、IL-4、IL-6、IL-10、干扰素(IFN)-γ试剂盒(美国RD公司)，全自动酶标仪(Rayto RT-6000)。

1.3AC大鼠模型的制作AC组于实验第1天给OVA 100 μg和佐剂Al(OH)35 mg磷酸盐缓冲液(PBS)0.2 ml左后足底部注射，第7天给同样OVA PBS液100 μg/0.2 ml腹腔注射。第14、16天给OVA PBS液(每眼750 μg/5 μl)点眼激发。NC组给予等量的PBS液，给药时间和途径同实验组。

1.4眼部临床评估在结膜囊OVA末次致敏后20 min，双盲法裂隙灯显微镜观察眼部体佂(均观察右眼)。根据Magone等〔5〕的标准评分。评分四项指标为：结膜水肿、结膜充血、眼睑充血水肿、流泪，分别计0～3分。结膜水肿评分标准：轻度局限结膜水肿1分；弥散水肿、穹隆部受累2分；结膜水肿致结膜嚢浅窄3分。结膜充血评分标准：轻度的弥散血管充血1分；弥散充血近穹隆部明显2分；充血伴结膜下出血3分。眼睑充血水肿评分标准：轻度眼睑充血水肿1分；眼睑弥散充血水肿睑裂变小2分；眼睑严重充血水肿、眼开困难3分。流泪评分标准：泪阜部泪液积存1分；泪液溢出睑缘2分；流泪不止3分。最后将4项指标各自积分相加得出总分。

1.5眼部病理学检测末次激发24 h断髓法处死大鼠，摘取眼球及上、下眼睑10%甲醛溶液固定，石蜡包埋，矢状位4 μm连续切片，Giemsa染色，观察大鼠眼结膜病理变化。计数穹隆部结膜每高倍镜下嗜酸性粒细胞浸润数。

1.6脾细胞培养摘取眼球及睑结膜后，无菌条件下取出大鼠脾脏，经100目钢网研磨过滤成单个细胞，用RPMI1640培养基(含100 mg/L小牛血清、100 mg/L青霉素及100 mg/L链霉素)重悬脾细胞。用8.3 g/L NH4Cl红细胞裂解液裂解红细胞，离心，收集细胞沉淀。用RPMI1640培养基重悬脾细胞，制成均质脾细胞悬液。取少量细胞悬液作台盼蓝染色，鉴定活细胞数(高于98%可用)。将脾细胞悬液调整到细胞数2×106ml-1。取脾细胞悬液100 μl加到无菌平底96孔板中，加入OVA至终浓度为100 μg/ml，并设立阴性对照，恒温培养箱培养72 h。收集培养上清液。

1.7细胞因子的测定分离大鼠脾脏同时，腹主动脉取血，分离血清。应用ELISA测定大鼠血清和脾细胞培养上清液IL-17、IL-4、IL-6、IL-10、IFN-γ含量。

1.8统计学方法采用SSPS19.0统计软件进行t检验、Pearson相关分析。

2　结　果

2.1大鼠眼部结膜炎症的临床评估在末次激发后20 min，裂隙灯显微镜观察，NC组眼部无明显异常改变，Magone炎症评分(0.79±0.14)分；AC组明显有眼部过敏症状，包括不同程度

的眼结膜水肿、充血，眼睑充血水肿、流泪，炎症评分(7.64±1.26)分，两组有明显差异(P<0.01)。提示AC组出现明显的急性期变态反应性炎症改变。

2.2眼部病理变化NC组眼结膜无明显充血水肿，固有层没有或偶见粒细胞浸润，穹隆部眼结膜每高倍镜下嗜酸性粒细胞浸润数(17.36±6.02)个；AC组结膜组织疏松，充血水肿明显，固有层内嗜酸性粒细胞及中性粒细胞浸润，肥大细胞增加，并有脱颗粒现象，结膜嗜酸性粒细胞浸润数(78.27±15.96)个，两组差异显著(P<0.05)。见图1。

2.3大鼠血清、脾细胞培养上清液IL-17、IL-4、IL-6、IL-10、IFN-γ水平与NC组比较，AC组血清、脾细胞培养上清液IL-17、IL-4、IL-6、IL-10水平明显升高(均P<0.01)，IFN-γ水平明显降低(P<0.01)。见表1。

图1　两组病理切片(Gimesa染色，×400)

组别n血清IL-17IL-4IL-6LL-10IFN-γ培养上清液IL-17IL-4IL-6LL-10IFN-γNC组1020.98±2.1888.76±6.3271.81±6.9482.28±9.4835.02±5.652.59±0.066.12±1.134.91±0.485.66±1.0223.45±3.87AC组2054.64±3.071)128.16±10.641)105.69±9.711)121.44±11.521)11.36±1.981)17.68±2.561)54.62±4.371)54.62±4.371)62.92±5.891)7.96±1.011)

与NC组比较：1)P<0.01，下表同

2.4大鼠血清IL-4/IFN-γ、IL-6/IFN-γ、IL-10/IFN-γ比值AC组血清IL-4/IFN-γ、IL-6/IFN-γ、IL-10/IFN-γ比值较NC组明显升高(均P<0.01)。见表2。

表2　两组血清IL-4/IFN-γ、IL-6/IFN-γ、IL-10/IFN-γ比值比较

2.5AC组血清IL-17与其他指标的相关性AC组血清IL-17水平与眼部炎症评分呈明显正相关(r=0.914,P<0.01)。AC组血清IL-17水平与眼结膜嗜酸性粒细胞浸润数呈明显正相关(r=0.956,P<0.01)。

3　讨　论

AC是眼结膜对外界致敏原发生速发型变态反应性疾病，T细胞是介导免疫应答的主要细胞。近年研究发现除辅助性T细胞1(Th1)和辅助性T细胞2(Th2)，在辅助性T细胞中还存在一类新的CD4+T细胞亚群，因其分泌的细胞因子以IL-17为主，因此被命名为Th17〔6〕。IL-17于1993年首次由Rouvier从激活的T细胞杂交瘤中克隆出，其结构独特，与目前已知的其他IL蛋白结构无相似性。近年来越来越多的研究证实Th17产生的IL-17参与许多变应性疾病，如过敏性哮喘、过敏性鼻炎的免疫炎症反应病理过程。在小鼠哮喘模型中Th17能上调Th2介导的嗜酸性粒细胞性气道炎症反应〔7〕。IL-17通过活化细胞外信号调节激酶P38促分裂原活化蛋白激酶和核转录因子-κb等信号激酶调节嗜酸性粒细胞功能，放大炎症反应〔8〕。IL-17介导哮喘气道中中性粒细胞的浸润，许多研究证明中性粒细胞浸润在哮喘发病中发挥十分重要作用〔9〕。研究发现变应性鼻炎患者鼻腔分泌物中IL-17水平较健康人明显升高〔10〕。变应性鼻炎患者外周血Th17细胞数量增加，血清 IL-17水平与患者临床症状的严重程度呈正相关，IL-17参与了过敏性鼻炎的炎症反应〔11〕。

本研究提示IL-17水平升高参与了大鼠AC发病的病理生理过程。IL-17作为前炎症因子能诱导上皮细胞、成纤维细胞释放IL-6、IL-8、粒-巨噬细胞集落刺激因子、巨噬细胞炎症蛋白-2和生长相关蛋白-α等炎症因子和趋化因子，刺激炎症反应，对T细胞活化起协同作用〔12〕。IL-17通过诱导IL-8和活化肥大细胞介导中性粒细胞浸润，促进嗜酸性粒细胞和中性粒细胞参与AC病理过程〔13〕。

Th1和Th2也通过产生不同的细胞因子介导免疫应答。Th1 产生IL-2、IFN-γ、肿瘤坏死因子(TNF)-α参与细胞免疫，Th2产生IL-4、IL-6、IL-10参与体液免疫。IL-4、IL-6、IL-10和IFN-γ分别为Th2和Th1细胞产生的特征性细胞因子。这两组细胞因子的水平分别代表Th2和Th1细胞的功能状态〔14〕。本研究结果表明AC大鼠Th2型细胞因子增多，Th1型细胞因子减少。AC大鼠表现为Th2型优势表达，Th2/Th1比例升高，免疫状态由Th1向Th2“克隆漂移”。Th2型细胞因子IL-4、IL-6、IL-10参与了AC发病的病理生理过程〔15〕。IL-4通过调节Ig重链基因类型的转换使B细胞由产生IgM转换成产生IgE，IL-4不仅促进B细胞表达分泌IgE还促进嗜酸性粒细胞的趋化〔16〕。IL-6能激活嗜酸性粒细胞，诱导嗜酸性粒细胞的分化和募集。IgE和嗜酸性粒细胞共同介导了大鼠AC的免疫病理过程。小鼠实验证明，在转化生长因子-β的协同作用下，IL-6可以诱导Th17分化，产生转移因子孤独受体γδ，促进Th17产生IL-17〔17〕。另有实验证明，应用IL-6中和抗体可阻断Th17细胞分化，抑制Th17介导的实验性自身免疫性脑炎的发生〔18〕。IL-6可促进Th17分泌IL-17。有研究证明，IL-4与IL-17可以共同促进IgE的合成分泌〔19〕。IL-17、Th17与Th2/Th1细胞比值变化相互作用、相互影响共同参与了大鼠AC的免疫学发病机制。恢复Th2/Th1失衡、抑制Th17免疫应答，减少IL-17产生或拮抗其生物活性可能成为AC治疗的一条新途径。

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〔2015-01-11修回〕

(编辑苑云杰)

黑龙江省卫生厅科研项目(No.2013248);佳木斯大学青年基金项目(No.Sq2014-006)

刘宏伟(1981-)，男，硕士，主治医师，主要从事眼表疾病、白内障疾病研究。

张剑(1977-)，女，硕士，主治医师，主要从事眼表疾病、白内障疾病研究。

R777.31

A

1005-9202(2016)15-3623-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.15.006