氧化苦参碱诱导人结肠癌SW480细胞凋亡的机制

张新星　张　璐　顾　清　代小松　陈和平

(四川省医学科学院　四川省人民医院，四川　成都　610072)



氧化苦参碱诱导人结肠癌SW480细胞凋亡的机制

张新星张璐顾清代小松陈和平

(四川省医学科学院四川省人民医院，四川成都610072)

目的探讨氧化苦参碱诱导人结肠癌SW480细胞凋亡的作用及机制。方法以不同剂量的氧化苦参碱作用于人结肠癌细胞株SW480，四甲基偶氮唑蓝法(MTT)检测细胞的增殖能力，Hoechst 33258 染色法观测细胞凋亡。免疫印迹法测定B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)的表达,荧光法测定半胱氨酸蛋白酶(caspase)-3的活性。结果氧化苦参碱可剂量依赖性地抑制细胞的增殖，促进细胞凋亡。Western印迹方法显示氧化苦参碱可抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，提高促凋亡蛋白Bax的表达，同时激活凋亡效应分子caspase-3。结论氧化苦参碱能够抑制结肠癌SW480细胞的增殖，通过提高Bax的表达、抑制Bcl-2的表达、激活caspase-3发挥其诱导细胞凋亡的作用。

氧化苦参碱；结肠癌；细胞凋亡

目前对于结直肠癌的治疗手段主要是手术，术后联合用氟尿嘧啶类药物进行化疗。氧化苦参碱(Oxymatrine)是豆科属植物苦参(SophoraflavescensAit)中分离出来的生物碱，具有很多生物活性，如抗病毒、抗炎、镇痛、强心、降压、调节免疫等〔1〕。近年来的研究发现氧化苦参碱具有显著的抗肿瘤活性，不仅可以抑制乳腺癌、食管癌、骨肉瘤细胞的增殖，而且能够诱导肿瘤细胞发生凋亡〔2～4〕。然而针对氧化苦参碱治疗结肠癌的研究较少。本研究以结肠癌细胞株SW480为研究对象,研究不同浓度氧化苦参碱对该细胞增殖能力和细胞形态的影响。

1　材料与方法

1.1药物及主要试剂氧化苦参碱、四甲基偶氮唑蓝(MTT)、Hoechst 33258以及半胱氨酸蛋白酶(caspase)-3活性测定试剂盒购自Sigma；胎牛血清来自杭州四季青；RPMI1640培养基、胰酶购自GIBCO。人结肠癌SW480细胞系,购自上海细胞所。α-Tubulin、B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)和Bcl-2相关X蛋白(Bax)单克隆抗体购自Cell signaling technology。

1.2细胞培养SW480细胞的培养基主要是1640，其中添加了10%胎牛血清、青霉素100 U/ml、链霉素100 U/ml。37℃,5%CO2孵箱培养,0.25%胰蛋白酶37℃消化2～4 min，隔天传代换液，用于药物实验的细胞保持处于对数生长期。

1.3细胞形态学变化及细胞增殖的检测将SW480细胞制备成浓度为2×104/ml的细胞悬液,接种在96 孔板中。按照实验设计加入不同剂量的氧化苦参碱(终浓度0.5，1，2 mg/ml)和阳性药物5-氟尿嘧啶(5-Fu，终浓度10 μg/ml)，每组分别设置3个平行孔,重复实验三次。药物作用24 h后在光学显微镜下观测细胞形态后，加入10 μl MTT(终浓度5 g/L)检测细胞活力。放入孵箱中反应4 h后,每孔加入100 μl二甲基亚砜溶解结晶,利用酶标仪在570 nm波长处测定各孔的光吸收值(A)。

1.4Hoechst33258 染色细胞以1×104个/ml的浓度接种于无菌盖玻片上,加入不同剂量药物(终浓度0.5，1，2 mg/ml)处理24 h后,加入0.5 ml固定液(4%多聚甲醛)固定细胞30 min后，磷酸盐缓冲液(PBS)清洗3次后加入Hoechst 33258(10 μg/ml)，盖过盖玻片为宜。避光放置在37℃恒温箱中10 min，可在荧光显微镜下观察。正常细胞的细胞核呈均匀的蓝色荧光，而出现深染或破碎的蓝色荧光则为凋亡的细胞。

1.5利用免疫印迹法(Western印迹)检测凋亡相关蛋白细胞种植在6孔板中，按照实验设计，药物处理24 h后，消化细胞，离心后加入细胞裂解液(加蛋白酶抑制剂)，冰上裂解30 min，期间每隔5 min涡旋震荡一次。离心取上清测蛋白含量，取20～50 μg蛋白加入等量上样缓冲液，沸水中煮4 min使蛋白变性。行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酸胺(SDS/PAGE)凝胶电泳,之后利用转膜仪将蛋白转至聚偏氟丙烯(PVDF)膜。血清封闭后加入一抗(Bcl-2,Bax,α-Tubulin,1∶1 000)4℃孵育过夜。洗膜后加入二抗(1∶2 000)室温孵育2 h,再次洗膜后加入化学发光试剂，曝光出现条带后保存,利用IMAGE J软件对蛋白印迹条带进行灰度值扫描分析。

1.6利用荧光法测定caspase-3 的活性细胞种植在六孔板中，按照实验设计，药物处理24 h后，消化细胞，离心后加入细胞裂解液。按试剂盒说明加入适当裂解液，混匀后在冰上裂解30 min。裂解液在4℃下离心10 min (12 000 r/min),取上清液并测定蛋白含量。用细胞裂解液将样本蛋白浓度调整到1～2 μg/μl。将50 μl反应缓冲液加到96孔培养板上，之后加入荧光底物DEVD-AFC 5 μl，最后加入样品50 μl,混匀后放入37℃恒温箱中约1.5 h,取出后利用荧光酶标仪在激发波长360 nm，发射波长460 nm 处测定荧光强度。

1.7统计学方法应用SPSS17.0软件行t检验。

2　结　果

2.1形态学观察氧化苦参碱对SW480细胞的作用加入不同剂量的氧化苦参碱作用24 h后，光学显微镜下观察到各加药组细胞数量较正常对照组减少，细胞变圆并皱缩。见图1。

2.2氧化苦参碱对SW480细胞增殖的影响0.5，1，2 mg/ml的药物可显著抑制细胞增殖〔增殖率分别为(87.7±3.5)%，(62.5±3.1)%，(46.5±4.2)%〕，且呈剂量依赖性关系，分别为正常对照组〔(100.0±2.1)%〕的87.7%，62.%和46.5%，阳性药物5-Fu组〔(42.1±1.2)%〕为对照组的42.1%，均有显著性差异(P<0.01)。

2.3氧化苦参碱诱导SW480细胞的凋亡见图2。加入氧化苦参碱的细胞出现凋亡现象，其细胞核的胞膜结构完整，但胞核发生碎裂或者浓缩，表现为致密的荧光，各浓度的氧化苦参碱均可诱导细胞凋亡。

图1　氧化苦参碱对SW480细胞形态的影响(×200)

图2　氧化苦参碱对SW480细胞凋亡的影响

2.4氧化苦参碱对抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax表达的影响药物处理细胞24 h后,蛋白印迹条带结果显示氧化苦参碱能抑制Bcl-2表达,同时增强Bax表达,且呈剂量依赖性(P<0.01)。见图3，表1。

图3　氧化苦参碱对Bcl-2和Bax表达的影响

指标正常对照组氧化苦参碱0.5mg/ml1.0mg/ml2.0mg/mlBcl-2100.0±4.168.9±5.51)43.5±2.11)39.5±5.21)Bax100.0±4.7119.8±6.51)184.0±5.11)221.0±9.21)

与正常对照组比较：1)P<0.01

2.5氧化苦参碱对caspase-3活性的影响 药物处理24 h后与正常对照组细胞〔(100.0±5.7)%〕相比，0.5、1、2 mg/ml的氧化苦参碱能增强caspase-3 的活性〔分别为(134.8±5.5)%、(199.1±8.2)%、(235.2±10.2)%〕，药物剂量越大，caspase-3活性越高(P<0.01)。

3　讨　论

有研究数据显示：60%以上肿瘤患者为65岁以上老年人，老年人患肿瘤的风险是中青年的11 倍，且消化道肿瘤所占比例最大〔5〕。研究报道老年人在手术切除肿瘤后的术后并发症和死亡率是其他年龄组的2～4倍，且此类手术风险随着年龄的增长而增高〔6〕。在我国，同样有调查研究发现老年患者因合并基础疾病多，术后发生并发症的比例可高达21.67%〔7〕。老年患者甚至因基础状况差无法承担手术及放化疗等治疗方案，寻求一种相对有效及安全的治疗方法可以改善老年结肠癌患者预后。

氧化苦参碱是从豆科槐属植物苦参中提取的一类生物碱，目前在临床上主要用于治疗多种原因引起的急慢性肝损害。此外，一般应用化疗药物会引起病人的白细胞减少，氧化苦参碱可用于治疗这类反应。现代药理研究证实其具有较好的抗肿瘤活性，文献报道氧化苦参碱能够诱导人乳腺癌细胞株MCF-7发生凋亡,抑制小鼠肉瘤细胞株S180和骨肉瘤细胞株OS732的增殖〔2～4〕。更值得关注的是氧化苦参碱能够抑制肿瘤细胞诱导血管内皮细胞发生增殖的作用〔8〕,同时还有提高免疫活性辅助性T细胞(Th细胞)以及白细胞数量的作用，进而提高整个机体的免疫能力。最近还有研究表明氧化苦参碱有镇痛作用〔9〕。以上的这些作用使氧化苦参碱在抗肿瘤药物研发中更具优势。临床常用的康艾注射液已被证实可用于原发性肝癌、肺癌、直肠癌等恶性肿瘤，且有较好的抑瘤作用,其主要的抑瘤成分即为氧化苦参碱〔10〕。本研究结果表明氧化苦参碱可剂量依赖性的抑制结肠癌细胞SW480的生长。在细胞凋亡过程中许多蛋白起着关键的作用，如Bcl-2蛋白家族。Bcl-2蛋白家族可分为抗凋亡亚族和促凋亡亚族，Bcl-2与Bax是主要的抗凋亡和促凋亡蛋白之一。前期大量研究发现Bcl-2蛋白的表

达增强后，引起Bcl-2与Bax蛋白比值的增高，在这种情况下可以抑制细胞的凋亡；反之，如果Bax蛋白表达增多，Bcl-2与Bax蛋白比值会下降，在这种情况有可能促进细胞凋亡的发生〔11〕。细胞凋亡的最后过程是通过caspase的激活而实现的，其级联式激活并溶解蛋白质〔12〕。caspase-3不仅是细胞凋亡的下游分子，也是效应分子，caspase-3被激活后，细胞凋亡基本上是不可避免的〔13〕。本实验结果显示氧化苦参碱可呈剂量依赖性抑制Bcl-2的表达，上调Bax表达,激活caspase-3，提示氧化苦参碱诱导SW480细胞发生凋亡的机制可能与其抑制抗凋亡Bcl-2的表达、上调促凋亡蛋白Bax的表达、提高凋亡下游关键蛋白酶caspase-3 活性有关。

1李正蓉.苦参素的药理与临床研究进展〔J〕.华西药学杂志,2003;18(6):435-7.

2周炳刚,孙靖中,范玉琢,等.氧化苦参碱诱导人乳腺癌细胞MCF-7 凋亡的实验研究〔J〕.中国药理学通报,2002;18(6):689-91.

3张立明,郑传莉.氧化苦参碱诱导骨肉瘤细胞凋亡的实验研究〔J〕.中国医院药学杂志,2006;26(10):1218-9.

4靳毅,胡建莉,彭纲,等.氧化苦参碱诱导人食管癌细胞株Eca109 凋亡的实验观察〔J〕.中国医院药学杂志,2009;29(11):891-4.

5王鹤,乔友林.老年恶性肿瘤流行病学、病因及预防〔J〕.中华老年多器官疾病杂志,2005;4(3):170-2.

6Seymour DG. Gastrointestinal surgery in old age: issues of equality and quality〔J〕.Gut,1997;41(4):427-9.

7张跃华.老年结肠癌451例治疗体会〔J〕.实用癌症杂志,2008;23(1):90.

8王兵,王国俊,蔡雄,等.氧化苦参碱抑制肝癌细胞诱导血管内皮细胞增殖作用的研究〔J〕.肿瘤防治杂志,2003;10(7):707-9.

9姜静,冯建伟,陈靖,等.氧化苦参碱的镇痛作用〔J〕.中药药理与临床,2012;28(6):50-2.

10黄素培,郜娜,乔海灵.康艾注射液对HO-8910肿瘤细胞增殖的抑制作用〔J〕.中国医院药学杂志,2011;31(14):1187-90.

11Galluzzi L,López-Soto A,Kumar S,etal.Caspases connect cell-death signaling to organismal homeostasis〔J〕.Immunity,2016;44(2):221-31.

12Savitskaya MA,Onishchenko GE.Mechanisms of apoptosis〔J〕.Biochemistry(Mosc),2015;80(11):1393-405.

13Fulda S.Targeting apoptosis for anticancer therapy〔J〕.Semin Cancer Biol,2015;31:84-8.

〔2015-11-17修回〕

(编辑袁左鸣)

The apoptosis of colon cancer SW480 cells induced by oxymatrine

ZHANG Xin-Xing,ZHANG Lu,GU Qing,et al.

Sichuan Academy of Sciences &Sichuan Provincial People's Hospital，Chengdu 610072,Sichuan,China

ObjectiveTo explore the apoptosis induction effects of oxymatrine and its mechanism on the human colon cancer SW480 cell line.MethodsThe morphological changes of SW480 cells after treatment with different concentrations of oxymatrine were observed. The proliferative ability and the apoptosis of SW480 cells were separately detected by MTT method and Hoechst 33258 staining. The expressions of Bcl-2 and Bax were analyzed by Western blot and Caspase-3 activity was detected by biochemical fluorescent.ResultsThe proliferation of SW480 cells was remarkably inhibited by 0.5,1 and 2 mg/ml oxymatrine. Oxymatrine induced apoptosis of SW480 cells. Moreover,oxymatrine downregulated Bcl-2 expression and upregulated Bax expression. The activity of Caspase-3 was also activated by oxymatrine.ConclusionsOxymatrine is able to inhibit the proliferation and induce the apoptosis of SW480 cells significantly. The mechanisms of oxymatrine on the apoptosis of SW480 cells might be realized by depressing Bcl-2 expression,enhancing Bax expression,and activating caspase-3 activity.

Oxymatrine;Colon cancer;Apoptosis

国家“973”计划项目(2012CB707900);四川省科技厅项目(2015SZ0039；2013JY0194)；成都市卫生局项目(2013006)

张新星(1979-)，女，硕士，主要从事老年消化相关疾病的研究。

R73

A

1005-9202(2016)15-3618-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.15.004