康体训练联合白藜芦醇干预治疗血管性痴呆大鼠模型的疗效

牛文亚

(新乡医学院体育教学部，河南　新乡　453003)



康体训练联合白藜芦醇干预治疗血管性痴呆大鼠模型的疗效

牛文亚

(新乡医学院体育教学部，河南新乡453003)

目的研究康体训练联合白藜芦醇干预对血管性痴呆(VD)的治疗作用。方法50只SD大鼠随机分为正常对照组、VD模型组、白藜芦醇组、康体训练组、康体训练联合白藜芦醇组。通过双侧颈总动脉永久性结扎法制备VD模型，各组大鼠按照分组原则进行处理。8 w后对大鼠进行认知功能检测,同时对大鼠大脑神经元进行光镜、电镜检测以及钙离子检测。结果通过大鼠跳台试验、避暗试验和水迷宫试验可观察到康体训练联合白藜芦醇组跳台、避暗潜伏期明显延长,通过水迷宫平台次数增加明显(P<0.05)。康体训练联合白藜芦醇组大鼠大脑神经元损伤明显减轻，钙离子荧光明显减弱。结论康体训练联合白藜芦醇干预对VD的治疗效果优于单独的药物治疗。

血管性痴呆；康体训练；白藜芦醇

血管性痴呆(VD)是由于缺血性或出血性脑血管疾病导致脑损害的一种临床综合征，以认知功能异常为突出表现〔1〕。白藜芦醇(Res)化学名为3，4'，5-三羟基芪，主要存在于葡萄、藜芦、虎杖、浆果和花生等植物中〔2〕，具有抗氧化、改善VD患者认知功能等作用〔3～5〕。有文献报道，康复训练能增加VD患者长时程记忆效应，改善认知功能〔6〕。如果Res联合康复治疗能够进一步改善VD患者认知功能，将对VD的治疗提供新的思路。本实验拟探讨康体训练联合Res干预VD的治疗效果。

1　材料与方法

1.1材料雄性清洁级Sprague-Dawley(SD)大鼠50只，4～5月龄，体质量180～220 g，许可证号：SYXK-豫-005-0012，河南省实验动物中心提供。动物房温度18℃～20℃，环境洁净度5 000～8 000级，相对湿度40%～50%，每小时换气20次，空气流动速度0.15～0.2 m/s，多级定向控制空气压差10%～15%，用自动定时器控制光照期为7：00～19：00、黑暗期为19：00～07：00，饲料为常规大鼠饲料、饮水为二次净化水。白藜芦醇(重庆科瑞南海制药有限责任公司)。主要仪器：电动转动仓(安徽正华生物仪器设备有限公司)，水迷宫(安徽正华生物仪器设备有限公司)。

1．2方法

1．2．1VD模型制备取雄性清洁级SD大鼠，术前12 h禁食、4 h禁水。采用10%水合氯醛(0.33 ml/100 g)进行腹腔注射麻醉，但保证术中自主呼吸。将大鼠仰卧位固定于手术台上，颈部备皮，消毒后颈部正中切口，分离双侧颈总动脉，在颈总动脉的近心端及远心端分别以双重“0”号线进行结扎，从中间离断，确保动脉血流完全阻断。手术切口给予2 ml庆大霉素后缝合创口，整个手术过程确保无菌操作。术后将大鼠移至通风条件良好的动物房继续饲养。

1．2．2试验分组每组10只。①正常对照组：常规饲养24 w。②VD模型组：采用双侧颈总动脉永久性结扎(2VO)制备大鼠VD模型。③Res灌胃组：每天清晨空腹予Res溶液灌胃(灌胃浓度1.35 mg/kg，灌胃容量10 ml/kg)，连续8 w。④ 康体训练组：每日3次在电动转动仓(转速20 r/min，半径20 cm)里面运动20 min，连续8 w。⑤ 康体训练联合Res灌胃组：在电动转动仓(半径20 cm，转速20 r/min)里面运动20 min，3次/d，连续8 w；每天清晨空腹予Res溶液灌胃给药(灌胃浓度1.35 mg/kg，灌胃容量10 ml/kg)，连续8 w。

1.2.3光镜观察用质量分数5%水合氯醛麻醉处死大鼠，采用4%多聚甲醛固定大鼠的脑组织，石蜡包埋切片(切片厚3～4 μm)，HE染色并于光学显微镜下观察。

1.2.4电子显微镜样品制作观察断头处死大鼠，取1 cm3的脑部正方形小块，4%戊二醛磷酸缓冲液4℃固定，Epon812包埋剂包埋，超薄切片，铅铀双染色，透射电镜(日立，H-7500)观察拍片。

1.2.5免疫荧光显微镜观察处死大鼠，制作冰冻切片(厚20 μm)。分别采用Ca2+一抗(1∶800)和荧光标记的二抗(1∶200)进行孵育，荧光显微镜下观察Ca2+在神经元胞质内的表达。

1.3统计学方法采用SPSS20.0软件，计量资料组间比较采用单因素方差分析，SNK-q法进行多重比较。

2　结　果

2.1大鼠跳台试验康体训练组大鼠与VD模型组相比跳台实验的潜伏期明显延长(P<0.05)；康体训练联合Res灌胃组与Res灌胃组比较(P<0.05)。康体训练组大鼠与VD模型组比较平均5 min错误次数明显减少(P<0.05)；康体训练联合Res灌胃组与Res灌胃组相比，也有显著性差异(P<0.05)。见表1。

表1　跳台试验结果

与VD模型组比较：1)P<0.05；与Res灌胃组比较:2)P<0.05；下表同

2.2大鼠避暗试验康体训练组大鼠与VD模型组比较避暗试验的潜伏期明显延长(P<0.05)；康体训练联合Res灌胃组与Res灌胃组相比较(P<0.05)。康体训练组大鼠与VD模型组比较平均5 min错误次数明显减少(P<0.05)；康体训练联合Res灌胃组与Res灌胃组相比较，有显著性差异(P<0.05)。见表2。

2.3大鼠水迷宫试验康体训练组大鼠与VD模型组比较通过平台次数明显增加(P<0.05)；康体训练联合Res灌胃组与Res灌胃组相比较，也有显著性差异(P<0.05)。各组的总游泳距离和平均游泳速度比较无明显差异。见表3。

表2　避暗试验结果

表3　水迷宫试验结果

2.4大鼠海马区神经元染色Res灌胃组和康体训练组与模型组相对比，大鼠海马CA1区的三层锥体细胞呈现规则排列；未发现明显细胞肿胀，细胞炎症无明显浸润，无增生的星形胶质细胞；锥体细胞形态基本正常，未见变小或胞体呈三角形，顶树突无明显延长，核固缩现象及核破裂现象不明显，胞质呈均匀的嗜伊红改变；部分锥体细胞核形态无明显异常，无明显的胞质疏松和微空泡形成现象；在血管周围无明显红细胞渗出，未见小血管增生现象。表明Res灌胃组及康体训练组对VD具有明显的抑制作用并且康体训练联合Res灌胃组的抑制作用优于Res灌胃组和康体训练组。见图1。

图1　大鼠海马区神经元染色结果(HE，×400)

2.5大鼠海马区神经元电镜结果Res灌胃组和康体训练组对比，镜下见血脑屏障内膜平滑；海马区神经元细胞体皱缩和膜结构模糊不清现象基本消失。而VD模型组可见细胞质内粗面内质网脱颗粒，内质网、线粒体出现肿胀，部分线粒体嵴融合或空泡样变性，细胞核固缩，双层核膜消失，核周呈锯齿状，异染色质明显边集；Res灌胃组及康体训练组对VD都具有明显的抑制作用，神经元形态改变不明显，细胞内线粒体的肿胀较少，细胞核膜清晰，边界清楚圆润，无异染色质边集现象。康体训练联合Res灌胃组的抑制作用优于Res灌胃组和康体训练组，其形态趋于正常对照组。见图2。

2.6大鼠海马区钙离子荧光试验结果VD模型组大鼠海马区神经元钙离子荧光显色明显增强，而康体训练组和Res灌胃组与模型组相比荧光显色减弱，康体训练联合Res灌胃组荧光减弱更加明显。可见Res灌胃组及康体训练组对VD具有明显的抑制作用，并且康体训练联合Res灌胃组的抑制作用优于Res灌胃组和康体训练组。见图3。

图2　大鼠海马区神经元电镜结果(×12 000)

图3　大鼠海马区钙离子荧光试验结果(×100)

3　讨　论

VD是脑血管病的常见并发症，其发病机制目前认为主要包括自由基损伤，兴奋性氨基酸对神经系统的毒性等。因此，使用自由基清除剂和兴奋性氨基酸抑制剂可能会延缓脑血管病的发生与发展并有助于防治VD〔7，8〕。Res具有的抗氧化、神经保护作用能对痴呆起到延缓效果，通过对脑神经元细胞器的进一步研究表明，Res具有一定的神经保护作用〔9〕。Res自身为植物雌激素，雌激素对中枢神经系统有促进神经元再生和抽芽及多种血管调节作用。据国外文献报道，雌激素替代治疗可以减轻实验性脑缺血损伤；流行病学调查结果也显示，女性绝经期后雌激素水平下降与心脑血管病的发生有紧密的关系，补充雌激素可有效减轻缺血性脑损伤且具有神经保护作用。

本研究提示，与VD模型组相比较，康体训练联合用药组跳台实验和避暗实验的潜伏期明显延长，大鼠通过平台次数与VD模型组比较明显增加，大鼠海马区神经元损伤明显减轻，钙离子荧光明显减弱。提示康体训练联合Res治疗能明显改善慢性缺血后大鼠的认知功能，效果优于单独的药物治疗。

康复训练改善VD大鼠认知功能障碍可能与改善雌激素从而减少海马神经元缺血坏死，减轻脑组织不可逆损害有关〔10～12〕。本研究发现，康体训练联合Res治疗对VD有明显的抑制作用,这将为更好地了解VD的发病机制以及通过康体训练治疗VD提供新的靶点。

1Lewis PR,著.高旭光,主译.MERRT'S 神经病学〔M〕.沈阳:辽宁科学技术出版社,2002:6.

2Fremont L．Biological effects of resveratrol〔J〕．Life Sci，2000;66(8)：663-73．

3Hung LM，Chen JK，Huang SS，etal．Cardioprotective effect of resveratrol，a natural antioxidant derived from grapes〔J〕.Cardiovasc Res，2000;47(3)：549-55．

4Goh SS，Woodman OL，Pepe S，etal．The red wine antioxidant resveratml prevents cardiomyocyte injury following ischemia-reperfusion via multiple sites and mechanisrm〔J〕.Antioxid Redox Signal，2007;9(1)：101-13．

5Ekshyyan VP，Hebert VY，Khandelwal A，etal．Resveratrol inhibits rat aortic vascular smooth muscle cell proliferation via estrogen receptor dependent nitric oxide production〔J〕.J Cardiovasc Pharmacol，2007;50(1)：83-93．

6王红卫,叶青，黄雁，等.康复训练对血管性痴呆大鼠胰岛素抵抗及海马胰岛素降解酶的影响〔J〕.中南大学学报(医学版),2013;38(11):1167-71.

7Baskys A,Hou AC.Vascular dementia:pharmacological treatment approaches and perspectives〔J〕.Clin Interv Aging，2007;2(3):327-35.

8Korczyn AD.Drugs for vascular dementia〔J〕.Lancet Neurol，2007;6(9):749-51.

9Luo Y，Nie J，Gong QH，etal．Protective effects of icariin against learning and memory deficits induced by aluminium in rats〔J〕.Clin Exp Pharm-acol Physiol，2007;34(8)：792-5．

10Plamondon H，Morin A，Charron C．Chronic 17 beta-estradiol pretreatment and ischemia induced hippocampal degeneration and memory impairments：a 6-month survival study〔J〕.Horm Behav，2006;50：361.

11Joffe H，Hall JE，Gruber S，etal．Estrogen therapy selectively enhances prefrontal cognitive processes：a randomized，double-blind，placebo-controlled study with functional magnetic resonance imaging in perimenopausal and recently postmenopausal women〔J〕.Menopause，2006;13：411．

12段立晖，周国庆，刘锦霞，等．雌激素对去卵巢大鼠学习记忆功能及海马神经元的保护作用〔J〕.临床神经病学杂志，2009;22：359．

〔2015-12-24修回〕

(编辑袁左鸣)

国家自然科学基金项目(81200836)；河南省科技厅科技攻关项目(132102310247)；新乡医学院重点研究领域招标课题资助项目(ZD2011-30)；新乡医学院培育基金(2014QN153、2014YB221)

牛文亚(1981-)，男，硕士，讲师，主要从事运动生理学研究。

R749.1

A

1005-9202(2016)15-3612-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.15.002