葡萄籽原花青素对放射性脑损伤大鼠学习能力和ERK1/2活性的影响

肖　颖，刘永亮

(1. 唐山市工人医院放化疗科；2. 唐山市人民医院神经外科，河北唐山　063000)



◇中医药研究◇

葡萄籽原花青素对放射性脑损伤大鼠学习能力和ERK1/2活性的影响

肖颖1，刘永亮2

(1. 唐山市工人医院放化疗科；2. 唐山市人民医院神经外科，河北唐山063000)

目的观察葡萄籽原花青素(GSPE)对放射性脑损伤大鼠学习能力和细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)活性的影响。方法120只雄性Wistar大鼠随机分为对照组，模型组，U0126组，低、高剂量GSPE组。用直线加速器进行脑部照射22Gy制作放射性脑损伤模型。HE染色观察海马区神经细胞形态变化；免疫组织化学法及免疫印迹法检测磷酸化的ERK1/2表达；穿梭箱评测大鼠学习能力。结果与模型组比较，U0126组海马区神经细胞结构损伤加重，磷酸化ERK1/2表达水平降低(P<0.01)，穿梭箱评测显示GSPE组动物主动回避反应率降低，被动回避潜伏期延长(P<0.01)；GSPE组海马区神经细胞结构损伤减轻，磷酸化ERK1/2表达水平增高(P<0.01)，穿梭箱评测显示GSPE组动物主动回避反应率明显升高，被动回避潜伏期缩短(P<0.01)；上述变化在高剂量GSPE组最为显著(P<0.01)。结论GSPE可以改善放射性脑损伤大鼠学习能力障碍，增强ERK1/2活性。

放射性脑损伤；学习能力；细胞外信号调节激酶1/2；葡萄糖原花青素

放射性脑损伤(radiationinjuriesbrain,RIB)是颅面颈区肿瘤放射治疗后的常见并发症，临床报道接受全脑照射的存活患者出现认知功能障碍的概率高达50%～90%，且认知障碍的程度往往与照射的剂量有关[1]。如何防治电离辐射造成的认知功能障碍已成为放射医学研究的热点。细胞外信号调节激酶1/2(extracellularsignalregulatedkinase,ERK1/2)是有丝分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedproteinkinases,MAPKs)家族的重要组成部分，活化后经多级激酶的级联反应把细胞外刺激信号向细胞内传递，从而介导细胞产生各种生物学反应；现已证实ERK1/2活性变化与脑损伤后认知障碍及痴呆的形成密切相关[2-3]。葡萄籽原花青素(grapeseedproanthocyanidinextract,GSPE)是从葡萄籽中提取出的生物类黄酮物质，具有极强的抗氧化和清除自由基作用[2]。动物实验报道，GSPE不仅可抑制肿瘤细胞的生长、迁移[4]，而且可减轻辐照引起的脏器损伤[5]。目前有关GSPE对RIB的研究尚少。本研究建立RIB模型，观察磷酸化的ERK1/2(活化的ERK1/2)表达变化，初步探讨GSPE防治RIB认知障碍的作用机制。

1　材料与方法

1.1动物分组和模型制备120只清洁级、健康雄性SD大鼠，体质量(245±15)g，月龄(2.8±0.3)月；采用随机数字法分组原则，分成对照组(n=24)、模型组(n=24)、U0126组(n=24)、高剂量GSPE干预组(n=24)、低剂量GSPE干预组(n=24)。各组分别分为照射后7、14、28d三个亚组，各时间组8只动物。

对照组：动物只进行常规麻醉，不进行照射；模型组：动物常规麻醉，参考文献[6]制作RIB模型，方法：采用德国进口加速器产生的6MeV电子线对大鼠进行单次全脑照射，源皮距为100cm，吸收剂量率250Mu/min，吸收剂量为22Gy；干预组：在动物进行照射前2周开始每天灌胃给药1次，持续给药观察时点，剂量分别为：高GSPE组200mg/kg、低GSPE组100mg/kg。

1.2学习能力的评测采用ZH-CSC型穿梭实验视频分析系统(ShuttleBoxSystem)测定动物行为学能力。将各组大鼠按时间点分别放入穿梭箱，适应5min消除探究反射后给予铃声刺激5s，继之给予电击20s，间隔10s后进入下一轮训练。训练中，如果在铃声刺激5s内大鼠逃向安全区，则为主动回避反应，系统自动停止当次训练；如果在铃声刺激5s内大鼠未逃向安全区，则给予1.5mA交流电20s，如果在电击后逃向安全区，则为被动回避反应阳性，否则为主动、被动回避反应阴性。每只大鼠电击30次，记录被动回避潜伏期(passiveavoidancelatency,PAL)、主动回避反应次数等参数。主动回避反应次数占总训练次数的百分比即为主动回避反应率(activeavoidancereactionrate,AARR)；AARR越高，PAL越短，表明动物学习能力越强。

1.3脑组织海马区的形态结构观察各组各时间点取4只大鼠，40g/L多聚甲醛灌注固定后，取脑，截取视交叉平面至大脑横裂脑组织。石蜡包埋、冠状切片，片厚5μm，HE染色，光学显微镜下观察。

1.4免疫组织化学法和免疫印迹法检测磷酸化ERK1/2表达免疫组织化学法：取材动物及标本采集与HE染色方法相同，切片常规脱蜡至去离子水，滴加复合消化液后入37 ℃温箱孵育20min，经PBS洗涤3次，每次5min，入30g/L过氧化氢封闭内源性过氧化物酶15min，经PBS洗涤后滴加兔抗鼠磷酸化ERK1/2多克隆抗体(1∶200)，4 ℃过夜；37 ℃复温45min，PBS洗涤后滴加生物素化二抗，37 ℃ 40min，PBS洗涤；DAB显色，苏木精轻度复染，脱水、透明、封片。在有测微尺的光学显微镜(20×10)下计数该视野下的阳性细胞数(细胞核中有阳性表达产物，染色呈棕黄色)。具体方法：每个标本取4张切片，在海马区随机选取4个视野，在有测微尺的光学显微镜(20×10)下观察海马区阳性细胞变化并计数(20×10)倍视野下的阳性细胞数量。

免疫印迹法：40μg蛋白样品与等体积上样缓冲液混合，煮沸10min后进行100g/L十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、转膜；加封闭液，室温下震荡2～3h后，加入磷酸化ERK1/2单克隆抗体(北京中山生物公司，1∶2 000)，4 ℃孵育过夜，用TBST洗膜，标记的二抗，经37 ℃孵育1h后，再次TBST洗膜；ECL显色，用图像分析仪测定吸光度，作定量分析。

2　结　　果

2.1各组穿梭实验结果与对照组相比，模型组动物的AARR减少、PAL延长(P=0.000)，且至照射后28d时，AARR和PAL恢复迹象不明显；与模型组相比，U0126组AARR减少、PAL延长(P=0.000)，而GSPE组动物的AARR增多、PAL缩短(P=0.000)，且28d时AARR和PAL恢复迹象明显(表1、表2)，上述变化在高剂量GSPE组最为显著。

表1各组大鼠AARR的比较

组别7d14d28d对照组76.84±4.7877.36±5.3477.68±5.53模型组45.63±0.90*32.71±0.65*34.50±0.78*U0126组34.82±1.20△24.55±1.86△28.48±1.60△低剂量GSPE组56.23±2.56*△44.66±2.79*△50.40±2.16*△高剂量GSPE组64.71±5.65*△▲50.51±5.86*△▲69.98±6.26*△▲

与对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，△P<0.05；与低剂量GSPE组比较，▲P<0.05。

表2各组大鼠PAL的比较

组别7d14d28d对照组17.68±1.7917.56±2.5517.53±3.64模型组40.11±1.57*51.13±1.89*49.08±1.78*U0126组48.44±1.96△61.20±2.08△55.70±1.92△低剂量GSPE组34.11±1.57*△45.52±1.88*△39.52±1.79*△高剂量GSPE组28.33±0.87*△▲36.53±2.70*△▲27.51±1.57*△▲

与对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，△P<0.05；与低剂量GSPE组比较，▲P<0.05。

2.2各组神经细胞形态结构的改变对照组神经细胞形态结构正常，神经元胞体较大，胞核大而圆，核仁清晰。模型组可见神经细胞变性水肿，细胞轮廓模糊；亦可见部分死亡神经细胞，表现胞体收缩呈多角形或不规则。U0126组神经细胞变性水肿，细胞轮廓模糊；可见较多死亡神经细胞，形态结构损伤更为严重。GSPE组神经细胞形态结构减轻，在高剂量组变化尤为明显(图1)。

2.3各组磷酸化ERK1/2免疫组化和免疫印迹结果免疫组化：磷酸化ERK1/2阳性表达主要位于细胞核，阳性细胞的胞核可见细小的棕黄色颗粒(图2)。对照组有少量磷酸化ERK1/2阳性细胞，染色棕黄；与对照组比较，模型组7、14d时间点磷酸化ERK1/2阳性细胞均增多，28d有所降低，但仍高于对照组(P=0.000)；与模型组比较，U0126组中各时间点磷酸化ERK1/2阳性细胞减少，而GSPE组中各时间点磷酸化ERK1/2阳性细胞增多，高表达状态持续至28d，在高剂量组变化尤为明显(P=0.000，表3)。

图1各组大鼠海马区神经元形态结构的变化

Fig.1Variationofthehippocampusneuronalmorphologyandstructureindifferentgroupsofratsunderlightmicroscope(×400)

A：对照组；B：模型组14d；C：U0126组；D：低剂量GSPE组14d；E：高剂量GSPE组14d。

图2各组大鼠海马区磷酸化ERK1/2免疫组化染色结果

Fig.2ImmunohistochemicalstainingresultsofthehippocampusphosphorylatedERK1/2indifferentgroupsofrats

A：对照组；B：模型组14d；C：U0126组；D：低剂量GSPE组；E：高剂量GSPE组。

组别7d14d28d对照组2.25±0.702.32±0.682.40±0.75模型组11.12±1.18*20.20±2.50*12.86±1.26*U0126组8.34±0.67△13.74±1.15△9.22±0.96△低剂量GSPE组13.20±1.45△27.40±2.52△19.80±1.30△高剂量GSPE组16.10±1.18△▲34.16±2.94△▲24.36±2.26△▲

与对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，△P<0.05；与低剂量GSPE组比较，▲P<0.05。

免疫印迹：以β-actin校准后的蛋白条带IA值反映其蛋白水平(图3)。与对照组比较，模型组7、14d时间点磷酸化ERK1/2表达水平增高，28d有所降低，但仍高于对照组(P=0.000)；与模型组比较，U0126组各时间点磷酸化ERK1/2表达水平降低，而GSPE组中各时间点磷酸化ERK1/2表达水平进一步增高，高表达状态持续至28d，在高剂量组变化尤为明显(P=0.000，表4)。

图3各组大鼠海马区磷酸化ERK1/2蛋白免疫印迹结果

Fig.3WesternblotofthehippocampusphosphorylatedERK1/2indifferentgroupsofrats

A：对照组；B：模型组 14d；C：U0126 组；D：低剂量GSPE组；E：高剂量GSPE组。

表4各组大鼠海马区磷酸化ERK1/2蛋白表达水平的比较

Tab.4ComparisonoftheexpressionofphosphorylatedERK1/2proteininthehippocampusindifferentgroupsofrats

组别7d14d28d对照组0.148±0.0100.124±0.090.126±0.07模型组0.396±0.110*0.648±0.136*0.446±0.118*U0126组0.288±0.102△0.432±0.114△0.310±0.112△低剂量GSPE组0.536±0.152△0.810±0.180△0.788±0.175△高剂量GSPE组0.860±0.174△▲1.064±0.162△▲0.948±0.140△▲

与对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，△P<0.05；与低剂量GSPE组比较，▲P<0.05。

3　讨　　论

本研究的结果显示，GSPE组动物不仅学习损伤程度轻，同时学习能力在早期即有恢复的趋势，表现在高剂量GSPE组动物在28d时主动回避反应率和被动回避潜伏期变化相对稳定，未出现模型组中持续下降的趋势，说明GSPE对RIB学习障碍有较好的防治作用。电离辐射可以造成脑内氧化应激、炎症反应、神经元损伤、神经递质释放紊乱等，进而造成认知能力损伤[7-8]。GSPE具有较强抗氧化作用，其抗氧化能力是VitE的50倍、VitC的20倍，与SOD相当；此外，GSPE具有抑制炎症通路激活和炎症反应的作用[9-10]。因此，应用GSPE可以降低RIB造成的认知障碍。

ERK1/2信号是MAPKs家族中研究最为深入的成员。研究发现，ERK1/2激活可通过基因表达、蛋白合成等影响神经细胞增殖分化、突触可塑性、轴突生长等，从而参与多种神经系统疾病的发生发展[11]。长时程增强(LTP)是与学习记忆密切相关的神经生物学基础。CRISTOG等[12]在研究中发现，海马区非依赖型LTP增强，需ERK1/2的活化，ERK1/2基因敲除的小鼠海马区LTP消弱或不能形成，动物表现出学习能力下降。ZHONG等[13]报道，当条件性敲除ERK1/2通路基因，不能诱导神经轴突生长；亦有研究显示，ERK1/2激活可通过提高神经细胞突触传递效能、提高兴奋性递质受体，进而诱导与维持LTP的形成[14]。国内学者梁庆[15]也证实对脑缺血大鼠的神经保护作用与提高脑内ERK1/2活化水平有关。本研究发现U0126组较模型组动物的AARR减少、PAL延长，说明ERK1/2信号活性变化是RIB学习记忆障碍的关键。

鉴于ERK1/2信号与学习能力关系的密切性，我们观察了GSPE对RIB大鼠海马区ERK1/2活性变化的影响，结果显示GSPE组中磷酸化ERK1/2在GSPE组呈剂量依赖式显著增高，且高表达时间延长，说明GSPE可提高海马区ERK1/2活性，可能是GSPE对放射性学习记忆损伤起到很好的防治作用的原因之一。

总之，本实验结果表明，GSPE增强RIB大鼠脑内ERK1/2活性，减轻RIB大鼠学习能力障碍。本研究为GSPE抗肿瘤及抗辐射的应用提供了一定的理论依据。

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(编辑韩维栋)

EffectsofgrapeseedproanthocyanidinonlearningabilityandERK1/2activityinaratmodelofradiation-injuredbrain

XIAOYing1,LIUYong-liang2

(1.DepartmentofRadiotherapyandChemotherapy,TangshanWorkers’Hospital,Tangshan063000;2.DepartmentofNeurosurgery,TangshanPeople’sHospital,Tangshan063000,China)

ObjectiveToobservetheeffectsofgrapeseedproanthocyanidinextract(GSPE)onlearningabilityandextracellularsignalregulatedkinase(ERK1/2)activityafterradiation-inducedinjurytothebraininrats.MethodsTotally120maleWistarratsweredividedintocontrolgroup,modelgroup,U0126group,andhigh-andlow-doseGSPEgroups.Theradiation-injuredbrainmodelswereestablishedbyusinglinearacceleratorirradiationin22Gy.ThemorphologicalchangesoftheneuronsinthehippocampuswereobservedwithHEstaining.TheexpressionofphosphorylatedERK1/2wasdetectedbyimmunohistochemistryandWesternblotting.Thelearningabilitywasassessedwithshuttlebox.ResultsComparedwiththemodelgroup,U0126grouphadincreaseddegreeofnervecellmorphologicalinjuryanddecreasedphosphorylatedERK1/2expressionlevel(P<0.01).ShuttleboxtestingshowedthattheactiveavoidancereactionratewasdecreasedandpassiveavoidancelatencywasprolongedinGSPEgroups(P<0.01);theGSPEgroupshaddecreaseddegreeofnervecellmorphologicalinjuryandincreasedphosphorylatedERK1/2expressionlevel(P<0.01).ShuttleboxtestingshowedthattheactiveavoidancereactionratewasincreasedandpassiveavoidancelatencywasshortenedinGSPEgroups(P<0.01).Theabove-mentionedchangesweremoresignificantinhigh-doseGSPEgroup(P<0.01).ConclusionGSPEcanreducelearningdisabilityofradiation-injuredbrainandpromotetheERK1/2activity.

braininjuryfromradiation;learning;extracellularsignalregulatedkinase

2015-08-07

2015-11-07

河北省卫生厅资助项目(No.20130384)

肖颖.E-mail:szg123@163.com

R742

A

10.7652/jdyxb201605025

SupportedbytheHealthDepartmentofHebeiProvince(No.20130384)

优先出版：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20160805.0946.002.html(2016-08-05)