山茱萸果核水提取物对D-半乳糖致衰老模型小鼠抗氧化能力的影响

胡志红　林搏浩　王晓娜　路西明

(河南科技大学医学院，河南　洛阳　471003)



山茱萸果核水提取物对D-半乳糖致衰老模型小鼠抗氧化能力的影响

胡志红林搏浩王晓娜路西明

(河南科技大学医学院，河南洛阳471003)

目的探讨山茱萸果核水提取物对D-半乳糖致衰老模型小鼠抗氧化能力的影响。方法选择50只昆明雄性小鼠随机分为正常对照组(10只)、模型组(10只)和提取物组(30只)。其中提取物组依据提取物剂量分为高剂量组(12 g·kg-1·d-1)、中剂量组(6 g·kg-1·d-1)、低剂量组(3 g·kg-1·d-1)，每组10只。正常对照组腹腔注射生理盐水，其余各组通过皮下连续8 w注射500 mg·kg-1·d-1D-半乳糖制备衰老模型。采用Morris水迷宫检测各组小鼠的学习记忆能力，完成测试后采用黄嘌呤氧化酶法测超氧化物歧化酶(SOD)活性，硫代巴比妥酸法测定丙二醛(MDA)，比色法测定总抗氧化能力(T-AOC)，DTNB法测定谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)。统计分析所有小鼠5 d内Morris水迷宫实验逃避潜伏期、穿越平台次数和脑组织MDA、SOD、GSH-Px、T-AOC含量。结果提取物组小鼠平均逃避潜伏期明显低于模型组，前者穿越平台次数高于后者(P<0.05)；但各剂量组间平均逃避潜伏期，穿越平台次数无显著差异(P>0.05)。提取物组小鼠MDA水平明显低于模型组，前者T-AOC、GSH-Px活性高于后两者(P<0.05)；提取物组小鼠SOD活性高于模型组，但无显著差异性(P>0.05)。结论山茱萸果核水提取物可能通过清除D-半乳糖模型小鼠产生过多的自由基，进而提高脑组织的抗氧化能力，从而起到延缓衰老的作用及改善衰老小鼠的学习记忆能力，中等剂量的效果最好。

山茱萸果核水提取物；衰老；抗氧化能力

山茱萸是一种山茱萸科的落叶乔木，其果肉具有多种有效化学成分及药效，被广泛应用于中医药治疗中，具有“救脱之功，抗衰之效，较参术芪更胜”之功效〔1〕。有研究表明，山茱萸干燥成熟果核具有多种有效化学成分，其果核提取物与果肉的成分相似，具有抗肿瘤、降压、耐疲劳、抗氧化等多种药理作用〔2〕。但在国内研究中，针对山茱萸果肉的药效研究较多，而关于其果核提取物的抗氧化作用研究较少〔3〕。本研究拟探讨其对小鼠学习记忆及抗氧化能力的影响。

1　资料与方法

1.1材料健康雄性昆明小鼠50只，SPF级，体质量18～22 g，实验动物许可证号SCXK(鄂)2010-0007，由河南科技大学医学院实验动物中心提供。WMT-100 Morris水迷宫视频跟踪系统(成都泰盟科技有限公司)，D-半乳糖(美国Sigma公司)，山茱萸果核(河南科技大学医学院提供)，超氧化物歧化酶(SOD)、总抗氧化能力(T-AOC)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、总蛋白定量(考马斯亮蓝法)试剂盒购自南京建成生物工程研究所，Feb-80台式高速离心机(上海天美生化仪器设备工程有限公司)，7220型分光光度计(上海精密科学仪器有限公司)。

1.2实验方法

1.2.1分组选择50只昆明雄性小鼠，均给予适应性饲养，随机分为正常对照组(10只)、模型组(10只)和提取物组(30只)。其中提取物组依据提取物剂量分为高剂量组(12 g·kg-1·d-1)、中剂量组(6 g·kg-1·d-1)、低剂量组(3 g·kg-1·d-1)，每组10只。

1.2.2模型和材料制备除正常对照组外，其余各组小鼠通过皮下注射500 mg·kg-1·d-1D-半乳糖，1次/d，持续8 w，以制备衰老模型。称取山茱萸果核500 g，经常规清水清洗、80℃烘干、粉碎研磨后，加入2 000 ml纯净水浸泡24 h；完毕后常规80℃加热、60目筛过滤和回收滤液及煎煮浓缩，完成后加水定容至生药量浓度为1.0 g/ml，并放入冰箱内贮藏；对提取组小鼠每日按对应剂量(3、6、12 g·kg-1·d-1)灌服山茱萸果核水提取液，正常对照组和模型组小鼠灌服适量生理盐水。

1.2.3Morris水迷宫实验所有小鼠于模型建造完成后进行Morris水迷宫实验。依据系统说明书及相关规定搭建水迷宫装置和安装视频摄像系统。完成后设置相关参数：水温(25±1)℃，水质为奶粉+水混匀，池壁上以4个等距离点将水池等分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ4个象限，圆形平台放置于第Ⅲ象限中央，低于水面2 cm，完成后开始进行实验，包括定位航行实验和空间探索实验。首先进行定位航行实验，实验期限为5 d，实验期间各参数、环境参照物等尽量保持一致，每只小鼠在实验开始前分别在4个象限中学习4次，每次游泳时限为60 s，系统自动记录其从放入水中到爬上平台所需的时间(即潜伏期)，对超过时限后仍未到达平台的小鼠进行引导，并使其到达平台停留10 s，此次潜伏期记为60 s。待定位航行实验结束后进行空间探索实验，即撤除圆形平台后，选择距离平台最远的象限中心作为入水点，观察记录小鼠在一定时间内的游泳轨迹及其跨越平台原来位置的次数。实验期间所有数据资料均通过Morris水迷宫实验视频摄像系统进行收集。

1.2.4脑组织SOD、MDA、T-AOC、GSH-Px的测定所有小鼠于Morris水迷宫实验结束后采用颈椎脱臼法处死，于冰上迅速剥离和取出全脑，通过低温生理盐水(3℃～4℃)清洗脑组织，加入适量低温生理盐水制备10%脑组织匀浆液，通过高速离心机常规分离，取上清液12 ml分别平均置入无菌抗凝试管A(用于MDA检测)、B(用于SOD检测)、C(用于GSH-Px检测)、D(用于T-AOC检测)。向试管中滴加适量检测试剂，采用黄嘌呤氧化酶法测SOD活性，硫代巴比妥酸法测定MDA，比色法测定T-AOC，DTNB法测定GSH-Px。其中蛋白质测定采用考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒，通过分光光度计检测其水平，所有操作均严格依据说明书相关规定进行。

1.3统计学处理采用SPSS20.0软件，各组间比较采用单因素方差分析。

2　结　果

2.1五组小鼠穿越平台次数比较提取物组小鼠穿越平台次数〔低、中、高剂量组分别为(2.14±0.98)、(2.31±1.12)、(2.08±0.45)次〕明显高于模型组〔(1.35±0.94)次〕(P<0.05)，但三个剂量组间比较无显著差异(P>0.05)。正常对照组为(3.78±0.59)次。

2.2五组小鼠平均逃避潜伏期比较在第1、2、3天，五组小鼠平均逃避潜伏期基本相同(P>0.05)。在第4、5天，提取物组小鼠平均逃避潜伏期明显低于模型组(P<0.05)，且三个剂量组无显著差异(P>0.05)。见表1。

2.3五组小鼠MDA含量，SOD、GSH-Px、T-AOC的活性比较提取物组小鼠MDA水平明显低于模型组，T-AOC、GSH-Px活性高于模型组(P<0.05)；提取物组小鼠SOD活性高于模型组，但无显著差异(P>0.05)，见表1。

表1　五组小鼠平均逃避潜伏期及MDA含量，SOD、GSH-Px、T-AOC的活性比较

与正常对照组比较：1)P<0.05，与模型组比较:2)P<0.05

3　讨　论

山茱萸果核水提取物是一种收涩药，在中医学中具有补益肝肾、涩精固脱之功效，可有效改善机体的体质，有利于延缓衰老〔4，5〕。有研究显示，山茱萸果核水提取物主治心下邪气寒热，温中，逐寒温痹，去三虫；久服轻身同兼强阴益精、安五脏、通九窍、止小便淋沥之功;久服明目、强力长年之功效，其药理药效具有抗氧化、改善记忆、免疫调节、降血糖等作用〔6，7〕。发现，该提取物可有效改善衰老小鼠的学习记忆能力，有效提高小鼠脑组织的抗氧化能力，从而起到延缓衰老的作用。本研究提示，在动物实验中，通过给予小鼠连续大剂量D-半乳糖，可有效氧化小鼠细胞，产生大量的自由基堆积在细胞内，进而发生强烈的脂质过氧化反应，影响其正常的渗透压，导致细胞正常生理活动受损引起衰老〔8，9〕。而山茱萸果核水提取物中含有多种皂苷类化合物，可能通过增强细胞内T-AOC、GSH-Px、SOD活性和抑制MDA水平，达增强细胞抗氧能力的作用。由于T-AOC、GSH-Px、SOD属于机体内的主要抗氧化酶，其活性增强可有效清除机体组织中自由基代谢产物，抑制自由基的脂质过氧化反应，减少氧化反应对生物膜的损伤，避免细胞外钙离子内流，线粒体内钙离子外流，进而降低脂质代谢产物MDA的含量，削弱线粒体内钙离子敏感脱氧酶的作用，保护机体细胞免受自由基氧化反应的损伤，从而起到延缓衰老的作用。此外，可能由于山茱萸果核水提取物提高抗机体免疫器官衰老退化的作用，有效保护脑组织细胞和脑神经细胞，使它们免受自由基氧化反应造成细胞结构、功能破坏；同时可能强化了它们的机体内抗氧化系统的防御能力，使细胞更快速、更有效清除氧化反应所产生的自由基，在双重作用下保护了脑组织，恢复自由基氧化作用与抗氧化防御作用的动态平衡，进而有利于促进脑神经细胞功能的修复，从而改善衰老小鼠的学习记忆能力〔10，11〕。本研究提示，小鼠脑组织可能对6 g·kg-1·d-1浓度的山茱萸果核水提取物更敏感，在此浓度下可更显著提高脑组织的抗氧化能力，具有更良好的延缓衰老和改善学习记忆能力的作用。

1吴慧,喻嵘,成细华,等.降糖益肾方干预胰岛素信号通路改善转基因2型糖尿病MKR鼠肾损伤的研究〔J〕.湖南中医药大学学报,2011;31(11):9-11.

2李小黎,叶翠飞,张丽,等.山茱萸环烯醚萜苷对脑缺血沙土鼠学习记忆能力和脑内神经营养因子的影响〔J〕.中华中医药学刊,2011;29(2):263-6.

3丁砚兵,吴霞.寿尔智含药血清对D-半乳糖所致AD模型大鼠神经递质受体通道电流的影响〔J〕.新疆中医药,2012;30(3):5-6.

4陈克芳,潘爱珍,侯祥平.山茱萸总苷对急性缺氧乳鼠心肌细胞凋亡通路的影响〔J〕.中药药理与临床,2014;30(6):54-7.

5陆艳,张雨霏,杨光明,等.山茱萸炮制过程中的红外光谱与美拉德反应〔J〕.南京中医药大学学报,2016;32(1):79-82.

6陈克芳,李建军,潘爱珍,等.山茱萸总苷干预急性缺氧乳鼠心肌细胞凋亡线粒体通路的研究〔J〕.中西医结合心脑血管病杂志,2015;13(8):970-2.

7郝帅,于飞,杨博,等.D-半乳糖对仔鼠脂质过氧化、听力和耳蜗毛细胞的损伤及其机制〔J〕.吉林大学学报：医学版,2012;38(3):419-22.

8顾翠英,韩志芬,夏花英,等.金雀异黄素对D-半乳糖损伤的乳鼠皮肤成纤维细胞的作用〔J〕.中国老年学杂志,2012;32(24):5461-4.

9梁华,孙燕佩,朱明雪,等.D-半乳糖所致衰老模型鼠的免疫功能变化〔J〕.中国临床保健杂志,2012;15(3):322-3.

10刘丰彬,沈梅.运动训练和补肽抗大鼠骨骼肌衰老机制的初步研究〔J〕.中国应用生理学杂志,2014;30(2):142-6.

11Hayashi T,Tachibana S,Nakao K,etal.Diaphragmatic endometriosis-associated pneumothorax triggered by abortion;report of a case〔J〕.Kyobu Geka,2011;64(13):1201-3.

〔2015-12-15修回〕

(编辑曲莉)

Effect of water extract of fructus corni officinalis core on the antioxidant capacity of aged mice model induced by D-galactose

HU Zhi-Hong,LIN Bo-Hao,WANG Xiao-Na,et al.

Medical College of Henan University of Science and Technology,Luoyang 471003,Henan,China

ObjectiveTo discuss the effect of water extract of fructus corni officinalis core on the antioxidant capacity of aged mice model induced by D-galactose.Methods50 male Kunming mice were randomly divided into normal control,model and high(12 g/kg),middle(6 g/kg),low(3 g/kg) dose extract groups.Morris water maze test was used to test the abilities of learning and memory.The xanthine oxidase method was used to measure the activity of superoxide enzyme(SOD),glucosinolates barbituric acid method was used to determine the activity of malondialdehyde(MDA),colorimetric method was used to determine the activity of total antioxidant capacity(T-AOC),DTNB method was used to determine the activity of glutathione peroxidase(GSH-Px).ResultsThe average escape latencies in extract groups were significantly lower than that of model group,the times through the platform were higher than that of model group(P<0.05).The MDA levels in extract groups were significantly lower than that of model group,the levels of T-AOC,GSH-PX activity were higher(P<0.05).The SOD activity of extract groups were higher than that in model group,but there were no significant differences(P>0.05).ConclusionsThe water extract of fructus corni officinalis core could improve the antioxidant abilities of brain tissue and improve the abilities of learning and memory in aging mice.

Water extract of fructus corni officinalis;Aged;Antioxidant capacity

河南省科技攻关计划项目(082102310031)

胡志红(1967-)，女，硕士，副教授，主要从事神经药理学研究。

R28

A

1005-9202(2016)16-3906-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.16.016