毛囊细胞移植治疗秃发疾病的实验基础研究

陈明娟，王原路，侯 刚

·基础研究·

毛囊细胞移植治疗秃发疾病的实验基础研究

陈明娟1，王原路1，侯 刚2

（1.广州市第一人民医院整形外科广东 广州510180；2.中山大学附属岭南医院骨科广东 广州510515）

目的：探索细胞移植诱导毛发再生模式，为毛囊细胞移植奠定实验基础。方法：利用酶消化法分离培养绿色荧光蛋白转基因鼠的表皮细胞和真皮细胞，分别进行体外培养扩增至第三代后注射移植入裸鼠皮下，观察其毛囊诱导能力。结果：表皮细胞移植无法诱导毛囊发育；真皮细胞移植仅诱导形成毛囊样结构；混合细胞移植能够诱导毛囊及毛干发育。结论：混合细胞培养可作为毛囊细胞体外培养模型，为毛囊细胞移植提供良好供体。

真皮细胞；细胞培养；毛囊；诱导；细胞移植

全球脱发治疗新进展研讨会曾公布调查结果显示：世界上大约有50%成年男性受到脱发困扰，脱发现象遍及世界各个地区各个民族。然而目前的治疗方法无法从根本上解决脱发这一难题，因此细胞移植诱导毛囊再生成为近年来研究的重点。已证实的同毛囊再生具有密切关系的细胞包括毛乳头细胞（Dermal papilla cells，DPCs）和毛囊干细胞（hair follicle stem cells，HFSCs），并能够进行体外扩增，为细胞移植提供大量的种子细胞。但是通过何种培养方式，能够获得大量具有毛囊诱导能力的种子细胞成为毛囊再生的首要问题。因此，本研究我们将探索细胞培养模式对毛囊发育的影响，最终确立一种科学的培养模型进行体外培养，从而为毛囊的正常发育提供稳定的环境，为毛囊组织工程重建和毛发移植的临床应用奠定实验和理论基础。

1　材料和方法

1.1实验动物与试剂：4～6周龄裸鼠，绿色荧光蛋白（GFP）转基因小鼠各一只，由南方医科大学实验动物中心提供。I型胶原酶、中性蛋白酶、胰酶（GIBCO公司）；磷酸盐缓冲液（PBS）（SIGMA公司）；胎牛血清（杭州四季青公司）；DMEM 高糖培养基，青、链霉素（杭州吉诺公司）；成纤维细胞生长因子FGF-2（SIGMA公司）；CD34、CD44、CD133（bs-0395R，BIOS公司）。

1.2种子细胞的分离与培养：取生后第1天的GFP转基因鼠1只，取其背部皮肤约0.5cm×0.5cm组织块，用0.1%中性蛋白酶4℃消化过夜。PBS（含1%青、链霉素）漂洗3次，用显微镊将表皮和真皮分离。分别剪碎，表皮用0.25%胰酶37℃消化10min，真皮以0.2%胶原酶37℃孵育约30min，直至所有组织被消化。加入DMEM高糖培养基（含10%胎牛血清）终止消化。200目筛网过滤，去除组织碎片和细胞团块，收集单细胞混悬液于离心管离心（1 000r/min）5min，重复离心2次，弃上清液，加入DMEM高糖培养基（含10%胎牛血清）。分别取表皮细胞悬液、真皮细胞悬液各1.5ml接种至25ml培养瓶中，加入2ml培养基，50g/L FGF-2，置于孵箱中，24h换液。待细胞贴壁后每3d换液1次，按1:2比例传至第三代。分别收集表皮细胞悬液、真皮细胞悬液以及表皮、真皮按1:2比例混合细胞悬液。

1.3流式细胞检测分析：将台盼蓝染色＞95%活力的表皮、真皮混合细胞以106/孔种于12孔板，0.25%胰蛋白酶收集细胞。重悬于含有1:50稀释的FITC-CD34和FITC-CD44抗体或1:20稀释的FITC-CD133抗体（以1:50稀释的mouse IgG/ FITC作为对照），37℃，30min。流式细胞仪激发波长Ex=488nm； 发射波长Em=530nm。检测阳性率。

1.4细胞体内移植：裸鼠用戊巴比妥钠麻醉，用1ml注射器将第三代细胞悬液分别注射移植至裸鼠背部皮下，注射后定期（2、4、8周）大体观察毛发发育情况。于第8周取移植部位组织，用4%多聚甲醛固定，常规石蜡切片，HE染色，荧光显微镜下观察。

2　结果

2.1细胞形态学观察：表皮细胞无法贴壁培养，真皮细胞及混合细胞接种后24h内贴壁。荧光显微镜下观察最初为小圆形，细胞大小不均匀（图1）。24h后逐渐伸展为梭形，4d 后形态呈成纤维细胞样，核呈椭圆形较大（图2）。原代培养的细胞7d 即达70%～80% 融合。细胞随着传代次数的增加，细胞体积逐渐增大。

图1　荧光显微镜下观察真皮细胞悬液（×10）

图2　真皮细胞接种24h后荧光显微镜下观察（×100）

2.2流式细胞检测结果显示：细胞流式分析阳性细胞百分比CD34（52.6%）；CD44（40.67%）；CD133（48.1%）；IgG（70.7%） （图3）。

图3　阳性细胞百分比　CD34（52.6%）； CD44（40.67%）； CD133（48.1%）；lgG（70.7%）

2.3细胞移植后观察：移植后2周，单纯表皮细胞受区未见明显变化，真皮细胞及混合细胞受区可见组织增厚，逐渐呈现轻微的隆起。移植后8周，取受区部位的皮肤行组织切片并染色，光镜下可见真皮细胞及混合细胞受区有大量呈同心圆排列的毛囊结构，其中心为嗜伊红染色的角化物质，向外依次为内根鞘、外根鞘、真皮鞘（图4）。混合细胞受区荧光显微镜下毛发发育清晰可见（图5），体视显微镜下可观察的到大量的毛囊、毛干形成（图6）。表皮细胞受区组织未见毛囊结构。

图4　显微镜下观察真皮细胞移植后2周受区的毛囊结构（HE×60）

图5　荧光显微镜下观察混合细胞移植后2周毛发发育情况（×5）

图6　皮下移植两周后有毛发纤维形成（×5）

3　讨论

对于哺乳动物来说，毛囊是一个特殊的器官，它由真皮和表皮成分组成。一个毛囊包括同心圆的上皮鞘（毛干，内根鞘，外根鞘），被同毛囊底部真皮乳头相连的真皮鞘围绕［1］。在外根鞘中间膨大部位称为膨出部有表皮干细胞的聚集。这些干细胞同毛囊底部的真皮乳头相互作用发育为不同类型的毛囊细胞［2］。毛发的发生最早始于胚胎期［3］。上皮细胞和间充质细胞之间的相互作用使表皮细胞增厚并形成基板，从而表皮下间充质细胞聚集成真皮浓集，最终发育为真皮乳头，即毛乳头［4］。DPCs和表皮细胞作为毛囊的两种主要成分通过相互的交流最终发育形成毛囊［5］。毛囊中的三种细胞成分，即外根鞘细胞、DPCs和真皮鞘细胞。其中真皮鞘细胞和DPCs 是主要的真皮源性细胞［6］，而外根鞘细胞则为表皮源性细胞［7］。

研究表明，CD34、CD133、CD44都是正常组织幼稚细胞的标志物。CD34分子是高度糖基化的I型跨膜糖蛋白，选择性地表达于人类及其他哺乳动物造血干/祖细胞表面，并随细胞的成熟逐渐减弱至消失，它是鼠毛囊干细胞中较好的表面标志。CDl33是在人类造血干/祖细胞上发现的一种跨膜糖蛋白，最初被认定为是造血干细胞的特异性标志，但后来发现CDl33蛋白在神经干细胞、表皮干细胞、内皮祖细胞等多种干/祖细胞中都有表达。Yuriko等研究证实，CD133同毛囊细胞诱导能力有关，可作为一种新的细胞表面标记来检测和分离具有毛囊诱导能力的真皮乳头细胞（DPCs）。CD44是种细胞粘附分子，已知其为分布极为广泛的细胞表面跨膜糖蛋白，主要参与异质性粘附，代表了细胞的聚集性生长能力。因此，本实验以CD34、CD44、CD133为标记来鉴定所获得的种子细胞的干细胞特性及其毛囊诱导能力。

本实验取材于新生GFP转基因鼠的皮肤组织，经过酶的消化最终得到表皮细胞和真皮细胞，其中包括大量的毛囊细胞及其前体。真皮细胞类似成纤维细胞样形态，且能够贴壁生长，符合真皮乳头细胞的特性。此外，我们将分离出的真皮细胞经流式细胞检测分析细胞表达CD34、CD44、CD133，其中CD34代表了所得细胞的干细胞特性，CD133说明细胞具有毛囊诱导能力，CD44则代表该细胞具有聚集性生长能力。检测结果表明所获得的细胞具有较强的毛囊诱导能力，可作为毛囊种子细胞进行体外培养扩增。成纤维细胞生长因子-2（FGF2）能够有力促进成纤维细胞有丝分裂， 最新的实验表明，毛乳头细胞在含有成纤维生长因子-2（FGF2）的培养基中，其诱导能力可以长期维持，而且当分散的毛乳头细胞聚集成球后其丧失的诱导能力可以恢复［8-10］，因此在体外培养扩增时加入FGF-2有利于细胞诱导毛囊再生能力的维持。本实验利用第三代细胞制备表皮细胞悬液、真皮细胞悬液以及1:2混合细胞悬液进行裸鼠皮下移植，2周便可观察到毛囊的形成，这充分显示通过培养的细胞具有毛发诱导能力，但混合细胞移植能够发育为毛干，提示我们表皮细胞和真皮细胞之间存在着某种特定的信号调节通路，两者相互作用才能发育为完整的毛发组织［11］。笔者之所以采用GFP转基因鼠，是因为其在荧光显微镜下更容易观察形成毛囊的细胞来源，发育形成的毛囊、毛干均呈绿色荧光表达则可以证明是由注射的细胞所形成。

本实验虽然证实体外培养扩增的毛囊细胞能够诱导毛发再生，但其诱导特性能够维持多久仍需要进一步的实验证明。尽管目前针对毛囊细胞的研究进展迅速，但对于毛囊的再生仍有许多问题亟待进一步的阐明，探索毛囊细胞间的联合培养模式及移植方式，为细胞疗法来解决秃发这一难题提供了实验依据。

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Experimental research of hair follicle cell transplantation for treatment of bald disease

CHEN Ming-juan1， WANG Yuan-lu1， HOU Gang2
（Department of Plastic Sugery， Guangzhou First People＇s Hospital，Guangzhou 510180，Guangdong，China）

ObjectiveExploring the mode of cell transplantation to inducing hair regeneration， for the experimental basis for the hair follicle cells transplantation.MethodsCultivate epidermal cells and dermal cells of green fluorescent protein transgenic mice by enzyme digestion method， then amplify in vitro respectively to the third generation. After that， transplant the cells in nude mice by subcutaneously injecting， observe the hair follicle induction ability.ResultsEpidermal cells transplantation could not induce hair follicle development； Dermal cells transplantation only induce formation of hair follicle structure. Mixed cells transplantation can induce the hair follicle and hair shaft.ConclusionMixed cells culture can be used as hair follicle cells in vitro culture model， that providing a good donor for hair follicle cells transplantation.

dermal cell ；cell culture； hair follicle；inducibility；cells transplantation

R322

A

1008-6455（2016）09-0071-03

2016-06-27

2016-09-05

编辑/张惠娟

毛囊细胞移植治疗秃发疾病的实验基础研究（2012B031800011）

王原路（1963-），男，主任医师，硕士研究生；主要研究方向为面部整形美容外科；E-mail:115415129@qq.com