复治肺结核患者痰液耐药结核分枝杆菌鉴定中荧光定量PCR与反向点杂交技术的联合应用

牛家峰，尚永明，张宁，刘义庆，张炳昌

(1淄博市第一医院，山东淄博255200；2山东省立医院)



复治肺结核患者痰液耐药结核分枝杆菌鉴定中荧光定量PCR与反向点杂交技术的联合应用

牛家峰1，尚永明1，张宁1，刘义庆2，张炳昌2

(1淄博市第一医院，山东淄博255200；2山东省立医院)

目的探讨荧光定量PCR联合反向点杂交技术在复治肺结核患者痰标本耐药结核分枝杆菌鉴定中的应用价值。方法 收集247例复治肺结核患者的痰标本，采用荧光定量PCR法检测结核分枝杆菌DNA，采用反向点杂交技术检测结核分枝杆菌耐药基因，以结核分支杆菌分离培养结果和抗结核药敏试验结果为金标准进行分析评价。结果 247例复治肺结核患者痰标本中，抗酸杆菌涂片镜检、结核分支杆菌分离培养和PCR对结核分枝杆菌的检出率分别为36.03%、45.55%和55.07%，PCR与抗酸杆菌涂片镜检对结核分枝杆菌的检出率相比，P<0.05；以结核分枝杆菌培养为金标准，PCR检出结核分枝杆菌的敏感度、特异度、阳性预测值阴性预测值分别为89.79%、72.88%、73.33%、89.58%，抗酸杆菌涂片镜检的敏感度、特异度、阳性预测值阴性预测值分别为69.38%、91.52%、87.18%、78.26%。以药敏试验结果为金标准，反向点杂交技术对利福平、异烟肼、链霉素、乙胺丁醇耐药基因的检出率分别为55.91%、49.46%、47.31%、31.18%。结论 联合应用荧光定量PCR与反向点杂交技术可快速、有效鉴定出复治肺结核患者痰标本中的耐药结核分枝杆菌。

肺结核；结核分枝杆菌；耐药性；聚合酶链反应；反向点杂交技术;分子诊断技术

我国目前仍是结核病流行严重的国家，且细菌耐药率较高。目前肺结核标准化疗方案由异烟肼、利福平、乙胺丁醇、吡嗪酰胺和链霉素5种一线抗结核药物组成，规范的四联标准化疗方案可使初治结核治愈率达到90%，但由于患者依从性差、用药不规范等原因，部分患者初治失败或治愈后复发[1～3]。现行的复治肺结核标准治疗方案仅在初治方案基础上对疗程和用药种类做统一调整，并未考虑到个体间耐药谱差异，导致疗效差异很大[4～6]，因此需要快速鉴定出耐药菌株，保护易感人群并及早制定个性化治疗方案[7～9]。WHO推荐使用分子生物学手段快速检测耐药突变，但单一实验检测效能并不高[1,9,10]。我们收集了部分复治结核病患者痰标本，分析荧光定量PCR联合反向点杂交技术在复治肺结核患者痰标本耐药结核分枝杆菌鉴定中的应用价值，现报告如下。

1　资料与方法

1.1 临床资料2014年1月～2015年11月淄博市第一医院结核科收治的复治肺结核患者247例，其中男158例、女89例，年龄18～85岁。复治肺结核诊断标准[11]：①初治失败的患者；②规则用药满疗程后痰菌又复阳的患者；③不规律化疗超过1个月的患者；④慢性排菌患者。其中标准化疗方案初治失败者95例，治愈后复发者81例，不规则化疗超过1个月者58例，多次治疗失败慢性排菌者13例。

1.2痰标本采集患者清晨以清水漱口清洁口腔后，深呼吸咳出痰液3～5 mL以无菌螺旋盖痰瓶收集。痰量过少时，可收集当天晚上至次日早晨的痰液。痰标本应为脓样、干酪样或脓性黏液样性质，痰样中含有血液或其他杂质的为不合格样本，应重新取样。

1.3荧光定量PCR法检测结核分枝杆菌DNA痰中加入2倍体积的4% NaOH，涡漩振荡器振荡液化。离心取沉淀，1 mL蒸馏水清洗沉淀离心，加DNA提取液50 μL，震荡混匀，100 ℃煮沸10 min，12 000 r/min离心10 min，上清液作为DNA模板。取模板DNA 2 μL，加入结核分枝杆菌核酸荧光定量PCR检测试剂，PCR反应条件：93 ℃、2 min预变性，93 ℃、45 s变性，55 ℃、60 s退火、延伸，共40个循环。核酸定量结果达到最低检出限(1×104copies/mL)，取模板DNA 4 μL，加入结核分枝杆菌耐药突变基因检测试剂盒PCR试剂，扩增条件：95 ℃、10 min预变性，95 ℃、45 s变性，54 ℃、30 s退火，68 ℃、60 s延伸，60个循环，68 ℃、5 min总延伸，以PCR扩增产物为反向点杂交底物。

1.4核酸反向点杂交法检测抗结核药物耐药基因参照试剂盒说明书配置缓冲液，取膜条放入15 mL离心管中，加入杂交缓冲液5 mL及对应PCR产物，沸水浴10 min，59 ℃杂交箱中摇浴杂交1.5 h，59 ℃预热洗液摇浴洗涤15 min，膜条转移至POD孵育液室温摇育30 min，杂交缓冲液摇洗两次，每次5 min。膜条浸泡于新鲜配制的显色液中，避光显色5 min，出现蓝色斑点即待检基因阳性。基因高频突变位点：利福平作用基因rpoB基因531位TCG→TTG、TGG，526位CAC→TAC、GAC，516位GAC→GTC、GGC；异烟肼作用基因katG基因3l5位点AGC→ACC、AAC，inhA基因-15位点；链霉素作用基因rpsL基因43位AAG→AGG，88位AAG→AGG、ACG；乙胺丁醇作用基因ATG→CTG、TTG、GTG、ATC、ATT、ATA。

1.5抗酸杆菌涂片镜检、结核分枝杆菌分离培养及抗结核药敏试验所有实验操作按照中国防痨协会2015版《结核病实验室检验规程》要求进行。结核菌分离培养阳性应用比例法进行药物敏感性试验，取菌落制备10-2、10-4mg/L的菌悬液，均匀接种至对照及含药培养基表面(培养基含利福平40 mg/L、异烟肼0.2 mg/L、链霉素4 mg/L、乙胺丁醇2 mg/L)，37 ℃培养28 d后观察结果。含药培养基上生长的菌落数/对照培养基上生长的菌落数>1%判定为受试菌对该抗结核药物耐药。

1.6统计学方法使用SPSS15.0软件进行处理。构成比、率的比较采用χ2检验P<0.05为差异有统计学意义。

2　结果

247例复治肺结核患者痰标本中，抗酸杆菌涂片镜检、结核分支杆菌分离培养和PCR分别检出结核分枝杆菌89(36.03%)、118(45.55%)和136(55.07%)例，PCR与抗酸杆菌涂片镜检对结核分枝杆菌的检出率相比，P<0.05。以细菌培养为金标准，PCR检出结核分枝杆菌的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值分别为89.79%、72.88%、73.33%、89.58%，抗酸杆菌涂片镜检的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值分别为69.38%、91.52%、87.18%、78.26%。

以药敏试验结果为金标准，分析93例反向点杂交试验数据，结果显示利福平、异烟肼、链霉素、乙胺丁醇耐药基因检出率分别为55.91%、49.46%、47.31%、31.18%。详见表1。

表1　反向点杂交法对复治肺结核患者痰标本中结核分枝杆菌耐药基因的检测效能

3　讨论

全国第五次结核病流行病学调查显示，复治肺结核患者结核分枝杆菌对一线抗结核药物利福平、异烟肼、乙胺丁醇、和链霉素中的任一药物耐药率高达35.9%[2]。目前山东省复治肺结核患者的结核分枝杆菌耐药率(20.9%)低于全国平均水平，但与初治患者耐药率相近(19.0%)，两者出现同步变化，形势依然严峻[12，13]。《WHO耐药结核病规划管理指南》认为抗酸杆菌涂片镜检对结核分枝杆菌的检出率低，且结核分枝杆菌生长缓慢，复治患者耐药菌株易漏检。因此，WHO推荐以分子生物学检测技术弥补传统检测手段的不足，正确判断排菌、快速发现耐药菌[1]。

目前可用于结核分枝杆菌检测的分子检测手段繁多，优势各有不同，而且其有效性多通过临床分离株进行验证[14～19]。由于WHO建议快速检测时限为2 d[1]，因此有必要组合多种技术手段优势形成检测途径，直接对痰液等原始标本进行检测，并对分子检测途径的有效性进行综合分析探讨。我们以荧光定量PCR法检测复治患者痰标本结核分枝杆菌DNA，定性判断排菌同时评估排菌量，再以反向点杂交技术检测结核分枝杆菌耐药基因，此检测途径耗时6～8 h，临床医生可当日获得利福平rpoB基因、异烟肼katG基因和inhA基因、链霉素rpsL基因、乙胺丁醇embB基因的主要耐药基因位点表达情况，据此给患者初步制定复治化疗方案和预防措施。而与之同步进行的结核分枝杆菌分离培养需要6～8周时间，进行药敏试验则再延长2～4周时间[7]，显然分子检测途径能有效缩短检测时长，避免诊断延迟。

对于复治肺结核患者，既往已经确诊感染，检测重点在于评估药物治疗效果，因此需要快速定性检测具有较高的阴性预测值以确定停止排菌、治疗有效，以及较高的敏感性有利于发现排菌、减少漏检率[20]。本研究247例复治肺结核病患者的痰标本中，PCR法的检出率(55.07%)高于痰涂片(36.03%)，与分离培养检出率(45.55%)差异无统计学意义。分析痰涂片与PCR定性检测结果发现，PCR检出结核分枝杆菌的敏感性(89.79%)与阴性预测值(89.58%)较高，显然以痰涂片检菌评估患者对的药物反应，其阳性检出率过低，对于复治患者漏检风险较大，而PCR法更适用于复治患者的快速筛选，且连续检测痰标本中结核分枝杆菌DNA含量也有利于监测患者排菌量。考虑到反向点杂交技术检测极限为1×104copies/mL，即并非所有结核分枝杆菌DNA阳性标本均能用于杂交实验，为保证耐药相关基因高频突变位点检测的有效性，有必要在PCR定性检测基础上，增加定量检测，避免医疗资源浪费。

我们以药敏试验为金标准评估反向点杂交技术在结核分枝杆菌耐药基因检测中的价值，结果发现结核分枝杆菌对4种一线抗结核药物的耐药基因检出率由高到低依次为利福平耐药基因(55.91%)、异烟肼耐药基因(49.46%)、链霉素耐药基因(47.31%)、乙胺丁醇耐药基因(31.18%)，与药敏试验结果无统计学差异，说明痰标本反向点杂交检测可快速有效检出耐药基因，在制定个体化复治方案同时，可早期采取有效措施保护易感人群。

我们分析反向点杂交技术检测不同药物耐药基因的敏感度、特异度、阴性预测值、阳性预测值，发现反向点杂交技术针对利福平耐药基因检测的敏感度、特异度、阴性预测值、阳性预测值最高，均在90%以上，异烟肼、链霉素耐药基因检测次之，四项指标在75%～80%，对乙胺丁醇耐药基因检出敏感度和阳性预测值仅为50%左右。根据Kappa值判定可靠性标准：0.41～0.8为中高度，0.81～1.0为最强度。反向点杂交技术检测利福平、异烟肼、链霉素和乙胺丁醇耐药基因的Kappa值依次为0.85、0.56、0.57和0.31，这说明反向点杂交实验对于4种一线药物用药选择的指导意义不尽相同，其中对利福平、异烟肼、链霉素耐药评价可靠性较高，而对于乙胺丁醇耐药评价可靠性较低，原因可能与检测膜条仅覆盖embB基因306位密码子少数高频突变位点有关，可结合后期细菌学实验结果，调整治疗方案。

结合上述研究结果，我们认为，联合应用荧光定量PCR和反向点杂交技术可快速、直接从痰标本中筛选出耐药结核分枝杆菌，在制定预防措施控制交叉感染同时，利用耐药基因检测结果，有助于早期制定个体化的治疗方案。

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张炳昌(E-mail: zhangbingchangb@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.31.022

R466.5

B

1002-266X(2016)31-0069-03

2016-05-12)