低氧环境下小鼠肾小球内皮细胞通透性的变化及其机制

王妍君，罗朋立

(青海大学附属医院，西宁810001)



低氧环境下小鼠肾小球内皮细胞通透性的变化及其机制

王妍君，罗朋立

(青海大学附属医院，西宁810001)

目的观察低氧环境对小鼠肾小球内皮细胞(MGEC)透通性的影响，并探讨其机制。方法 取处于对数生长期的MGEC，将细胞分为低氧1组、低氧2组、抑制剂1组、抑制剂2组和对照组。低氧1、2组分别在10%、5%氧浓度的低氧环境中培养36 h；抑制剂1、2组细胞先加入重组人VEGF抑制剂继续培养48 h，然后分别在10%、5%氧浓度的低氧环境培养36 h；对照组细胞常规培养，不做特殊处理。各组细胞分别于低氧处理0、12、24、36 h测算单层MGEC对白蛋白的通透率，反映细胞通透性；采用real-time PCR法检测小鼠MGEC中的VEGF mRNA。结果 低氧1组、低氧2组培养0、12、24、36 h时细胞通透率逐渐升高，同组不同时点相比，P均<0.05；低氧1、2组培养12、24、36 h细胞通透率高于抑制剂1、2组及对照组(P均<0.05)。低氧处理12、24、36 h低氧2组细胞通透率高于低氧1组。低氧1、2组培养0、12、24、36 h时细胞中VEGF mRNA相对表达量均逐渐升高，组内不同时点相比，P均<0.05；低氧1、2组培养12、24、36 h细胞中VEGF mRNA相对表达量高于抑制剂1、2组及对照组，且低氧2组VEGF mRNA相对表达量高于低氧1组(P均<0.05)。结论 低氧环境下小鼠MGEC通透性升高，可能与细胞中VEGF mRNA表达上调有关。

低氧损伤；肾小球内皮细胞；细胞通透性；血管内皮生长因子

内皮细胞有着复杂的生理和代谢功能，其结构和功能受损已被确认是创伤、休克、急性呼吸窘迫综合征、多器官功能衰竭、肿瘤等多种疾病发生的病理基础之一[1～3]。肾小球内皮细胞(MGEC)可维持肾小球毛细血管结构的完整性和滤过障碍功能，维持和调节肾小球血流动力学功能，还有抗凝、防血栓形成的作用。MGEC损伤后，细胞发生变性、脱落、增生[4，5]。低氧状态可诱导一系列与血管新生、能量代谢、肿瘤转移等密切相关的基因表达，帮助机体适应低氧微环境[6，7]。缺氧导致的MGEC完整性被破坏、通透性改变是肾脏组织病理改变和功能紊乱发生的重要原因[8，9]。2013年6月～2015年7月，本研究观察了低氧环境对小鼠MGEC透通性的影响，并探讨其机制，现报告如下。

1　材料与方法

1.1细胞与材料小鼠MGEC购自上海斯信生物科技有限公司，加入PRMI1640培养基，接种于24孔板，在5% CO2培养箱中培养。重组人VEGF抑制剂购自上海斯信生物科技有限公司，Streptavidin、HRP-streptavidin、生物素标记牛血清白蛋白(Biotin-BSA)均购自西宁城北默克实验仪器经营部，其余试剂均为分析纯。酶联包被缓冲液(NaHCO30.05 mmol/L，Na2CO30.05 mmol/L，pH 9.6)，PBS-BSA封闭液(NaCl 140 mmol/L，KCl 2.7 mmol/L，Na2HPO44.3 mmol/L，K2HPO41.4 mmol/L，0.5 %BSA，pH 7.4)，PBS(含0.1%Tween-20，pH 7.4)，PBS(含0.5%BSA、0.1%Tween-20)。

1.2细胞分组与低氧处理方法取处于对数生长期的小鼠MGEC，将细胞分为低氧1组、低氧2组、抑制剂1组、抑制剂2组和对照组。低氧1、2组分别在10%、5%氧浓度的低氧环境中培养36 h；抑制剂1、2组细胞先加入重组人VEGF抑制剂继续培养48 h，然后分别在10%、5%氧浓度的低氧环境培养36 h；对照组细胞常规培养，不做特殊处理。

1.3小鼠MGEC通透性检测各组分别于低氧处理0、12、24、36 h参考文献[10]的方法检测细胞通透性。细胞通透性检测装置由6孔细胞培养板和微孔细胞培养嵌套组成。微孔细胞培养嵌套置于6孔培养板的小井中，构成两个相对隔离的小室(内室和外室)。用PBS将Biotin-BSA稀释为10 g/L，取15 μL加入内室细胞培养液中，使Biotin-BSA 终浓度为100 mg/L，同时加入不同剂量的VEGF，定期收集内室和外室培养液各10 μL，计算单层MGEC对Biotin-BSA的通透率(反映MGEC通透性)：外室Biotin-BSA浓度/内室Biotin-BSA浓度×100%。

1.4小鼠MGEC中VEGF mRNA检测根据GenBank 提供Rat mRNA序列，采用Primer E×Press2.0软件进行引物设计。VEGF引物：上游5′-GGTGAGAGGTCTACTAGTTCCGA-3′，下游5′-CCATGAACTTTCTGCTCTTC-3′；GAPDH引物：上游5′-GTGCCAAAAGGGTCATCATCTC-3′，下游5′-GGTTCACACCCATCACAAACATG-3′；U6引物:上游5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。分别于低氧处理0、12、24、36 h取各组细胞提取总RNA，取2 μg总RNA进行逆转录合成cDNA，进行real-time PCR反应。PCR反应体系包括DEPC水5.3 μL、real-time PCR缓冲液2 μL、上下游引物各0.1 μL、RNA酶抑制剂0.1 μL、混合酶0.4 μL、底物1 μL。PCR反应条件：94 ℃预变性2 min，94 ℃ 15 s、64 ℃ 35 s扩增40个循环，70 ℃ 5 min，64 ℃ 35 s。读取荧光，以2-ΔΔCt表示目的基因的相对表达量。

2　结果

2.1各组细胞通透率比较低氧1组、低氧2组低氧处理0、12、24、36 h时细胞通透率逐渐升高，组内不同时点相比，P均<0.05；低氧1、2组低氧处理12、24、36 h细胞通透率高于抑制剂1、2组及对照组(P均<0.05)。低氧处理12、24、36 h低氧2组细胞通透率高于低氧1组。详见表1。

表1　各组细胞通透率比较

注：与同组培养0 h时相比，aP<0.05；与同组培养12 h时相比，bP<0.05；与同组培养24 h时相比，cP<0.05；与同时点抑制剂1组、抑制剂2组、对照组相比，*P<0.05。

2.2各组细胞中VEGF mRNA表达比较低氧1、2组培养0、12、24、36 h时细胞中VEGF mRNA相对表达量均逐渐升高，同组不同时点相比，P均<0.05；低氧1、2组培养12、24、36 h细胞中VEGF mRNA相对表达量高于抑制剂1、2组及对照组，且低氧2组VEGF mRNA相对表达量高于低氧1组(P均<0.05)。详见表2。

表2　各组细胞中VEGF mRNA相对表达量比较

注：与同组培养0 h时相比，aP<0.05；与同组培养12 h时相比，bP<0.05；与同组培养24 h时相比，cP<0.05；与同时点抑制剂1组、抑制剂2组、对照组相比，*P<0.05；与低氧1组相比，#P<0.05。

3　讨论

MGEC是覆盖于肾小球毛细血管壁腔侧的内皮细胞，与血流直接接触，对白细胞、细菌有黏附作用，对基底膜有修复作用。有研究[11]认为，低氧状态会影响MGEC对NO的分泌功能。NO为内皮源性舒张因子，生理水平的NO具有维持肾脏血流量、抗氧化应激、降低内皮细胞对蛋白质的通透性及抑制血小板聚集等作用。而低氧状态下MGEC分泌的NO水平降低，导致机体血管内皮功能紊乱，破坏MGEC的完整性、通透性，最终导致肾脏组织发生病理改变和功能紊乱。蛋白尿是肾脏疾病常见临床表现，其与肾小球滤过膜通透性增高密切相关。MGEC是滤过膜的主要组成部分，其通透性改变将直接影响肾小球滤过膜的功能[12]。

VEGF在血管形成和病理血管生长过程中都发挥重要作用，低氧是引起VEGF表达的强效诱导剂[11]。VEGF具有调节调节血管生成、血管通透性和血管活性物质合成等功能，其中调节血管生成是VEGF最重要的作用[13,14]。研究[15]发现，小鼠在低氧环境中脑组织中VEGF表达最多，肾脏、睾丸、肺和肝脏的表达也有所增加。在体内，低氧可损害血脑屏障，引起血管源性脑水肿。低氧环境下，脑组织中VEGF mRNA及蛋白表达上调，其表达水平与低氧程度有关。低氧时，体外培养的脑血管内皮细胞对荧光素钠的通透性较正常情况下增加2倍，而使用VEGF抗体中和VEGF则可消除低氧引起的脑血管通透性增高，这表明低氧时脑VEGF表达增加，是低氧引起脑血管内皮细胞通透性增高的重要机制之一[16]。

VEGF在肾脏主要分布于MGEC及肾小球足细胞，其在MGEC中的作用机制目前尚不清楚。VEGF在病理状态的肾脏组织中高表达，且与蛋白尿程度呈正相关关系。MGEC是肾脏滤过屏障的重要组成部分，也是VEGF作用的靶细胞，VEGF可能通过增加其通透性在肾脏病患者蛋白尿形成中发挥作用，但上述观点尚未得到充分的证据来证实[17,18]。本研究参考鲍永霞等[19]的研究，选择10%和5%的氧浓度制作低氧模型。本研究分别采用10%、5%氧浓度条件培养小鼠MGEC，结果显示低氧1组、低氧2组培养0、12、24、36 h时细胞通透率逐渐升高，且高于抑制剂1、2组及对照组，低氧处理12、24、36 h低氧2组细胞通透率高于低氧1组。提示低氧可造成MGEC通透性增高，且氧浓度越低对MGEC的损害越严重。本研究结果还显示，低氧1、2组培养0、12、24、36 h时细胞中VEGF mRNA相对表达量均逐渐升高，高于抑制剂1、2组及对照组，且低氧2组VEGF mRNA相对表达量高于低氧1组，推测低氧状态下VEGF表达上调可能与MGEC通透率增高有关。

目前对VEGF介导低氧性血管内皮通透性增高相关的信号传导通路还不了解。阻断丝裂原蛋白激酶(MAPK)和蛋白C对血管内皮通透性没有影响，说明MAPK和蛋白C在低氧和VEGF诱导的血管内皮通透性增高的病理过程中无明显作用[20]。低氧和VEGF诱导的血管内皮通透性增高与磷脂酶Cγ、磷脂酰肌醇3激酶和蛋白激酶G的激活有关。低氧可造成细胞膜紧密连接蛋白(闭锁小带1、闭锁小带2)间断表达，闭锁小带1、闭锁小带2的表达从细胞膜移至细胞质甚至细胞核内，而阻断磷脂酶Cγ、磷脂酰肌醇3激酶和蛋白激酶G则可消除低氧引起的这些改变，提示低氧或VEGF可通过重新排列内皮细胞膜上的紧密连接蛋白引起血管内皮细胞通透性增高。低氧时内质网储存的钙离子释放入胞质，可能是低氧时VEGF表达增加的信号传递物质。

综上所述，低氧状态可造成小鼠MGEC通透性增高，细胞中VEGF mRNA表达上调，低氧对MGEC通透性的影响可能是通过调节VEGF表达实现的。

[1] 李明红,袁志兵,高钰琪.白藜芦醇对低氧内皮细胞炎症反应的影响及机制研究[J].中国病理生理杂志,2015,31(10):1798.

[2] 闫镇楠,冯红,刘卫.血管内皮细胞低氧损伤的分子机制[J].长治医学院学报,2014,28(1)：71-74.

[3] 吴胜春,石晓明,杨永宾,等.低氧状态下血管内皮细胞HIF-1α表达及与细胞凋亡的关系[J].中国现代医学杂志,2014,24(10):6-10.

[4] 张洋,马坤岭,王桂花,等.血小板微粒活化促进糖尿病肾病肾小球内皮细胞损伤[J].中国药理学通报,2015,31(B11)：109.

[5] 伍俊霞,周芸.肾小球内皮细胞改变及其在慢性肾脏病发病机制中的作用研究进展[J].国际移植与血液净化杂志,2015,13(3)：5-8.

[6] Haris AL. Hypoxia: a key regulatory factor in tumor growth[J]. Nat Rev Cancer, 2002,2(1): 38247.

[7] Semenza GL, Agani F, Booth G, et al. Structural and functional analysis of hypoxia- inducible factor 1[J]. Kidney Int, 1997,5(4):553.

[8] 张竞丹,杨丹凤,曹燕卿,等.低温低氧复合应激对大鼠肺微血管内皮细胞的损伤作用研究[J].中国应用生理学杂志,2013,29(3):219-223.

[9] 陈小菊,程德云,樊莉莉.低氧对大鼠肺动脉平滑肌细胞和肺微血管内皮细胞表达及分泌fractalkine的影响[J].四川大学学报(医学版),2012,43(5):661-665.

[10] 陈朝红,刘志红,余晨,等.一种体外研究肾小球内皮细胞通透性的方法[J].肾脏病与透析肾移植杂志,2002,11(5):497-500.

[11] 梁立峰，张惠莉，罗朋立，等.低氧、高糖对肾小球内皮细胞膜表面多糖-蛋白复合物厚度影响的分析[J].中国糖尿病杂志,2015,23(12):1103-1105.

[12] 何珊,赵俪月,巴晓晔,等.苯妥英钠对大鼠骨髓间充质干细胞与血管内皮细胞VEGF和SCF分泌的影响[J].西安交通大学学报：医学版,2016,37(2)：204-208.

[13] 胡义杰,李志平,陈建明,等.低氧诱导肺动脉内皮细胞转分化的初步机制研究[J].局解手术学杂志,2013,22(6):594-596.

[14] 王德光,李学旺,李航,等.胰岛素通过激活P13K/mTOR通路诱导人肾小球系膜细胞血管内皮细胞生长因子转录[J].中国糖尿病杂志,2009,17(4)：308-310.

[15] Mo SJ, Hong J, Chen X, et al. VEGF-mediated NF-κB activation protects PC12 cells from damage induced byhypoxia[J]. Neurosci Lett, 2015,(610):54-59.

[16] Bavil FM, Alipour MR, Keyhanmanesh R, et al. Ghrelin decreases angiogenesis, HIF-1α and VEGF protein levels in chronic hypoxia in lung tissue of male rats[J]. Adv Pharm Bull, 2015,5(3):315-320.

[17] 杨婧,王琛,祝婷婷,等.益气养血泄浊法对慢性肾功能衰竭大鼠肾组织形态的影响及VEGF表达的作用机制[J].中华中医药杂志,2015,30(11)：4077-4080.

[18] 刘亚明,邓君,匡仁锐,等.肾积水后缺氧诱导因子-1、血管内皮生长因子、微小RNA-210的动态表达[J].重庆医学,2015,44(30)：4196-4198.

[19] 鲍永霞,吕福祯,马迎军.低氧对小鼠缺氧诱导因子-1α、P53 和血管内皮生长因子表达的影响[J].中国康复医学杂志,2006,21(5):408-411.

[20] Chen T, Chen M, Chen J. Ionizing radiation potentiates dihydroartemisinin-induced apoptosis of A549 cells via a caspase-8-dependent pathway[J]. PLoS One, 2013,8(3):e59827.

青海大学2013年度中青年科技基金项目(2013-QYY-9)。

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.31.009

R692.6

A

1002-266X(2016)31-0031-03

2016-02-24)