水稻抗氧化酶活性对Cd胁迫的应答及其对Cd吸收的影响

王娟娟

摘 要：该文首先研究了4个水稻品种的Cd吸收积累状况，并对水稻的Cd积累类型作出区分，之后对水稻体内各抗氧化酶与水稻Cd吸收的关系进行了分析。结果显示，GR活性与茎叶Cd含量之间存在显著负相关（P<0.05），且GR在低积累型水稻体内的活性显著高于高积累型（P<0.05），APX的研究结果则和GR相反。这表明，GR活性的提高对减少Cd吸收也起到积极的作用，APX则起到消极作用。

关键词：水稻；镉；抗氧化酶；积累

中图分类号 S511 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2016）16-0021-04

Abstract：In present studies，Cd uptake and distribution of 4 rice cultivars have been studies by a pot trial（added with 10mg Cdkg-1）and a hydroponic experiment under 4 Cd levels（0、25、50 and 100μM）. Then，the responses of the antioxidant enzyme of rice under Cd stress，and the relationship between activities of antioxidant enzyme and rice Cd uptake have been also explored by a hydroponic culture.The results showed that there were significant differences in activities of glutathione reductase（GR）and ascorbic acid peroxidase（APX）among 4 rice cultivars，especially between W2168 and RBQ. The activities of GR in RBQ were higher than in W2168，APX were opposite. In addition，significant positive correlation existed between Cd concentrations and APX activities in shoot（P < 0.05）. Activities of GR were negatively related to Cd concentrations in shoot（P < 0.05）.These results indicated that，the improvement of the activities of GR may reduce the rice Cd uptake. APX were opposite.

Key words：Rice；Cd；Antioxidant Enzyme；Accumulate

随着农田Cd污染状况的加剧，土壤中Cd含量的增加，已经严重影响到了土壤的环境质量，并且带来了一系列严重的环境问题[1]。因Cd污染带来的粮食作物食品安全问题也越来越严重，因此，减少和控制水稻Cd积累，已经成为治理Cd污染的主要问题[2]。传统的物理、化学和生物修复方法，因成本高、修复周期长等原因，无法大面积应用，因此，从现有的水稻品种中筛选或挖掘植物自身潜力并借助基因工程手段培育出对重金属高耐性、低积累的水稻品种，在目前被认为是最经济有效的解决途径。

在对各种逆境的不断适应过程中，生物体进化形成了完善且复杂的由酶类和非酶类物质组成的抗氧化系统来清除活性氧。研究表明，酶类物质可以使体内的活性氧自由基变为活性较低的物质，从而削弱它们对植物体的伤害[3]。抗氧化系统的调节作用，使生物体内活性氧维持在较低水平[4]，从而使植物可以进行正常的生长和代谢。大量研究表明[5-6]，抗氧化酶活性的提高能减轻重金属对植物造成的氧化伤害。因此，抗氧化系统对植物的重金属抗性的提高有着重要意义。有研究表明，组成抗氧化系统的保护酶对活性氧、自由基的防御能力是决定植物逆境抗性的重要因素[7]。

对农作物而言，提高其重金属抗性并不是最终的目的，而获得高耐性﹑低积累的水稻品种才是目标所在。现有的研究显示，抗性的提高并不意味着Cd吸收﹑积累量的减少，有时高耐性也伴随着高积累[8]。因此，考察抗氧化系统对农作物的Cd吸收和积累的影响具有重要意义，但是目前关于这方面的研究很少。本研究在实验室以前的调查研究基础上初步确定4个水稻品种五丰优2168﹑天优998﹑粤香占以及日本晴作为研究材料，首先通过室内实验，比较4个品种的Cd吸收﹑转运﹑积累方面的差异，对其积累类型作进一步的确认与区分。然后，借助营养液培养并添加外源Cd处理的方法来探究这些水稻在不同Cd胁迫条件下的Cd吸收﹑积累规律及抗氧化酶的应答机制，揭示各抗氧化酶组成与水稻Cd吸收的关系，为高耐性﹑低积累水稻品种的筛选和培育提供理论基础。

1 材料和方法

1.1 土培实验

1.1.1 土壤及处理 稻田0～20cm表层土壤，经风干，磨碎，过筛。其土壤理化性质如下：pH值5.64，有机质9.74%、总氮1.30g/kg、总磷1.13g/kg、总钾0.60g/kg、总Cd0.23mg/kg；砂质∶壤质∶粘质为30.6∶36.4∶33.0。盆栽实验处理：CK和Cd（10mg/kg）。称取1.5kg土壤装入PVC盆中，Cd处理以Cd（NO3）2 溶液的形式加入，加水混匀后保持水层，平衡20d备用。

1.1.2 水稻品种 4个品种水稻种子：天优998（TY998）﹑粤香占（YXZ）﹑五丰优2168（W2168）和日本晴（RBQ）。日本晴和五丰优2168两个品种在中国广泛种植。

1.1.3 育苗及种植 4个水稻品种种子经晒种、选种和消毒后，去离子水洗净，均匀撒播与土砂培养基表面，保持水分，育苗20d。选取大小适中的幼苗移入已装有土壤的CK及Cd处理盆中，每个品种每个处理下4个重复，每盆3株。实验在温室中进行，自然光加补光灯控制，室内温度控制在26～35℃，相对湿度70%～85%，定期浇水。分别在孕穗前期﹑灌浆初期及成熟期各收获一批。将根﹑茎叶及谷粒分开，其中根与茎叶经去离子水冲洗干净后，60℃烘干至恒重，和谷粒一起称重。

1.1.4 指标测定 将去壳之后的糙米与已经烘干的根﹑茎叶用粉碎机粉碎后，称取一定量的样品加浓硝酸（70%优级纯），微波消解45min，过滤﹑定容﹑装管，4℃保存。所有消化样Cd含量由原子吸收分光光度计（AAS，Z-230，HITACHI，Japan）测定。

1.2 水培实验

1.2.1 水稻品种及育苗方法 同土培试验。

1.2.2 移苗 取生长状况一致的水稻幼苗，移至黑色塑料板中，棉花固定，1/2强度Hoagland营养液培养，营养液每3d一换。Hoagland营养液配方如表1所示。

1.2.3 Cd处理 选取生长状况一致的水稻幼苗，分别用0、25﹑50﹑100μmol·L-1Cd浓度营养液处理7d，营养液为1/2强度。

1.2.4 指标测定 （1）根﹑茎叶Cd含量测定：同土培试验。（2）各抗氧化指标的提取与测定：①APX提取及测定方法。取0.3g水稻叶片，在研钵中研磨成粉（加液氮），移入离心管中，加入3mL提取液混匀，4℃下，10 000xg离心30min，取上清液取上清液装管保存。3mL反应体系包括：0.1mol·L-1pH7.5 PBS缓冲液，50μL的酶提取液，0.5mmol·L-1 ASA，最后加入30% H2O2 2μL启动反应，空白管不加H2O2，测定3min内A290nm处OD的变化值。A290nm处，抗坏血酸（ASA）的毫摩尔消光系数为2.8mM-1·cm-1。酶活单位μmol ASA g-1·min-1表示。②GR提取及测定方法：取0.3g水稻叶片，在研钵中研磨成粉（加液氮），移入离心管中，加入3mL预冷的提取液混匀，4℃下，10 000xg离心30min，取上清液装管保存。3mL反应体系包括：0.1mol·L-1 pH7.8 PBS缓冲液，2mmol·L-1 Na2EDTA，0.5mmol·L-1 GSSG，酶提取液50μL，最后加入NADPH 3μL启动反应，空白管不加NADPH，测定A340nm处3min内OD的变化。A340nm处，NADPH毫摩尔消光系数为6.2mM-1·cm-1。酶活单位μmol NADPHmg-1·min-1。

1.3 数据分析 利用统计软件SPSS18.0对数据进行统计分析。单因素方差分析和多重比较采用ANOVALSD法，显著性水平取P<0.05。Origin7.5制作分析图。

2 结果与分析

2.1 水稻对Cd的吸收﹑转运及积累

2.1.1 土培条件下水稻对Cd的吸收﹑转运及积累 10mg·kg-1Cd处理土培条件下，4个水稻品种不同生育期收获后，Cd吸收﹑积累﹑转运情况如表2所示。差异性分析结果表明：（1）在同一生育期，不同水稻品种之间的茎叶Cd含量存在显著差异。灌浆初期，五丰优2168和粤香占茎叶Cd含量显著高于天优998和日本晴。成熟期，五丰优2168茎叶Cd含量最高，其次是粤香占，日本晴含量最低。其中五丰优2168显著高于其他3个品种，和日本晴的差异最大，前者是后者的4.98倍；（2）在同一生育期，不同水稻品种间Cd转移率也存在显著差异。灌浆初期，粤香占转移率最高，和天优998及日本晴差异显著。成熟期，五丰优2168的转移率最高，日本晴最低；（3）五丰优2168的糙米Cd含量最高，且其和粤香占的糙米Cd含量显著高于日本晴。

2.1.2 水培条件下水稻不同部位Cd吸收 不同浓度Cd处理后，各品种水稻茎叶及根部Cd含量如表3所示。随着Cd处理浓度的增加，各品种水稻茎叶及根部Cd含量有逐渐增加的趋势。差异性分析结果表明：25μM Cd处理下，五丰优2168和粤香占根部Cd含量显著高于天优998和日本晴（P<0.05），但4个品种茎叶Cd含量无显著差异。50μM Cd处理下，五丰优2168茎叶Cd含量最高，但各品种根部Cd含量无显著差异。100μM Cd处理下，五丰优2168各部Cd含量显著高于日本晴，但与粤香占和天优998之间差异不显著。

2.2 不同浓度Cd处理条件下抗氧化酶对水稻Cd吸收的影响

2.2.1 水稻抗氧化酶对Cd胁迫的应答 不同浓度Cd处理后，4个品种水稻地上部APX活性变化如图1所示。结果显示：正常生长条件下，4个品种水稻之间APX活性无显著差异。25μM Cd浓度下，日本晴APX活性显著低于其他品种。50μM浓度下，五丰优2168和粤香占APX活性显著高于日本晴和天优998。100μM浓度下，五丰优2168和日本晴之间APX活性差异显著，前者高于后者。

不同浓度Cd处理后，4个品种水稻地上部GR活性变化如图2所示。结果显示：25μM浓度下，天优998GR活性显著高于粤香占和日本晴，粤香占和日本晴的GR活性显著高于五丰优2168。50μM浓度下，天优998和日本晴的GR活性显著高于五丰优2168和粤香占。100μM浓度下，4个品种间GR活性无显著差异。

2.2.2 相关性分析 0～100μM范围内的不同浓度Cd处理水培条件下，地上部Cd含量与地上部抗氧化指标活性相关关系如表4所示。相关性性分析结果表明：APX与茎叶Cd含量之间存在正相关关系，GR相反。且地上部Cd含量与抗氧化指标活性或含量之间存在显著相关性（P<0.05）.APX活性与茎叶Cd含量之间在25μM﹑50μM﹑100μM Cd浓度处理下均存在显著正相关。GR活性与茎叶CD含量之间在50及100μM Cd浓度处理下显著负相关。

3 讨论与结论

土培和水培试验中，供试的4个水稻品种在茎叶Cd含量﹑根部Cd含量﹑Cd由根部向地上部的转移率﹑谷粒Cd积累量方面均存在显著差异（P<0.05，表2，表3）。这表明，水稻对Cd的吸收及积累存在品种间差异。事实上，本研究中我们发现，10mg·kg-1Cd土培实验中，五丰优2168和日本晴之间在不同生育期下的根部Cd含量﹑茎叶Cd含量﹑Cd由根向地上部的转移率﹑谷粒Cd积累量方面均存在显著差异（P<0.05，表2）。其中前者的积累量显著高于后者。不同浓度Cd处理水培实验中，25μM Cd处理下，五丰优2168根部Cd含量显著高于日本晴（P<0.05，表3）。50μM Cd和100μM Cd处理下，五丰优2168各部Cd含量均显著高于日本晴（P<0.05，表3）。因此，为便于后续分析，本研究将五丰优2168定义为Cd高积累型品种，日本晴定义为Cd低积累型品种。

水培实验中，APX活性方面，25μM﹑50μM﹑100μM Cd处理下，五丰优2168的APX活性显著高于日本晴（P<0.05，图1）。25μM和50μM处理下，天优998和日本晴的GR活性显著高于五丰优2168和粤香占（P<0.05，图2）。此外，本文还对水稻地上部Cd含量与抗氧化指标活性或含量的相关关系进行探究，结果发现，4种Cd浓度处理下，APX与茎叶Cd含量之间呈正相关关系，且某些处理下显著正相关（P<0.05，表4）。通过前面的土培及水培实验结果，可知五丰优2168的籽粒Cd积累量较高，而日本晴正好相反。综合以上结果，推测APX活性的提高在增强水稻的Cd抗性的同时，也可能间接促使水稻吸收更多的Cd，即高抗性﹑高吸收。有学者通过比较超富集植物天蓝遏蓝菜和非超富集植物烟草在Cd处理下体内的过氧化物和抗氧化酶含量，发现Cd超富集植物具有更强的抗氧化能力；烟草的生长明显受到抑制，而天蓝遏蓝菜却能正常生长。由于天蓝遏蓝菜具有较强的抗氧化防御能力，所以它对重金属的富集和耐受能力也很强[9]。同理，4种Cd浓度处理下，GR与茎叶Cd含量之间均呈现负相关关系，且GR在某些处理下与茎叶Cd含量之间显著正相关（P<0.05，表4）。这一结果表明，GR活性的提高的同时，水稻对Cd的吸收减少。

总之，本研究结果表明，抗氧化系统各组分对水稻Cd吸收及积累的影响力是不同的，本研究发现GR抗氧化酶活性的提高在增强水稻Cd抗性的同时，在减少Cd吸收方面也起到积极的作用，但APX活性的提高在增强水稻的Cd抗性的同时，可能会间接促使水稻吸收更多的Cd。虽然机理方面的原因尚待进一步探究，但这一研究结果为Cd低积累水稻品种的分子育种提供了一定的理论基础。

参考文献

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（责编：张宏民）