中心组合设计优化野葛糖化工艺

褚　冲，姚尚杰，黄　钧，吴重德，周荣清，2*

（1.四川大学 轻纺与食品学院，四川 成都 610065；2.四川大学 制革清洁技术国家工程实验室，四川 成都 610065）

中心组合设计优化野葛糖化工艺

褚冲1，姚尚杰1，黄钧1，吴重德1，周荣清1，2*

（1.四川大学 轻纺与食品学院，四川 成都 610065；2.四川大学 制革清洁技术国家工程实验室，四川 成都 610065）

以野葛为原料，采用葡萄糖当量值（DE值）为评价指标，在单因素试验的基础上，利用中心组合设计试验优化野葛糖化工艺条件并建立回归方程。结果表明，野葛糖化的最佳工艺参数依次为酶解时间220 min、pH 4.2、酶添加量528 U/g、酶解温度58℃。在此工艺条件下糖化液DE值可达到（79.93±0.20）%。

野葛；糖化；葡萄糖当量值；中心组合设计

野葛〔Pueraria lobata（Willd.）Ohwi〕别名甘葛、葛藤等，为豆科葛属多年生草质藤本植物，也是我国卫生部公布的药食同源植物，极富开发价值［1］。野葛中含有大量淀粉，也富含钙、磷、钾、铁、锌等多种人体所必需的矿质元素。野葛的主要功效成分有葛根素、大豆苷、芦丁等异黄酮类物质，因此具有很高的食用和药用价值，已成为开发新型保健食品的首选原料之一［2-3］，各式各样的野葛保健功能食品也陆续问世［4-6］。目前，虽然广泛研究了野葛中黄酮类、淀粉的提取工艺［7-9］，但仍然缺乏合理利用的相关研究，其淀粉常作为废弃物而被直接丢弃，使得这些资源未被合理利用。基于野葛淀粉特性的酶解工艺可为野葛资源的合理利用奠定重要基础，以富含淀粉的野葛为原料发酵生产功能性保健酒，同时实现葛根素、黄酮类与淀粉的共用。

响应面分析法（response surface methodology，RSM）是一种能有效优化工艺过程参数的分析方法［10-11］。该方法通过研究各因素及其交互作用的特点选择合适的试验设计，并对其结果进行回归分析来寻求最优工艺参数，进而揭示其关键变量的贡献度并且预测其影响规律［12-14］。本试验以野葛作为研究对象，通过单因素试验初步探讨各因素对葡萄糖当量值（dextrose equivalent，DE）的影响规律后，再运用中心组合设计试验分析并建立回归模型，以期得到最佳的酶解工艺条件，同时也为野葛酶解工艺的进一步开发提供理论基础。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

野葛：市售，高速粉碎后过40目筛储藏备用；液化酶（酶活力126 000 U/g）、糖化酶（酶活力240 000 U/g）：诺维信生物技术有限公司；其余试剂均为国产分析纯。

1.2仪器与设备

PHS-3C精密酸度计：上海仪电科学仪器股份有限公司；WZS-18手持式折射仪：上海仪电物理光学仪器有限公司；DZKW-4电子恒温水浴锅：北京中兴伟业仪器有限公司。

1.3方法

1.3.1工艺流程

1.3.2野葛液化液的制备

取野葛粉5.00 g置于150 mL三角瓶中，按料液比1∶10（g∶mL）沸水浴加热30 min糊化；待温度降至65℃，α-淀粉酶用量为25.2 U/g，恒温酶解36 min。得野葛液化液。

1.3.3糖化单因素试验

酶解时间的确定：液化液pH调至4.5，糖化酶用量为432 U/g，置于60℃水浴中，分别保温120 min、140 min、160 min、180 min、200 min、220 min、240 min，灭活测定其DE值。

pH的确定：分别将液化液pH调至3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0，糖化酶用量为432 U/g，置于60℃水浴保温180 min，灭活测定其DE值。

酶添加量的确定：液化液pH调节至4.5，酶添加量分别为288 U/g、336 U/g、384 U/g、432 U/g、480 U/g、528 U/g、576 U/g，置于60℃水浴保温180 min，灭活测定其DE值。

酶解温度的确定：液化液pH调至4.5，以酶添加量432U/g加入糖化酶，分别置于40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃水浴保温180 min，灭活测定其DE值。

1.3.4糖化工艺响应面优化

在单因素试验的基础上，运用Design-Expert 8.0.5b软件，采用中心组合设计［15］优化野葛糖化工艺参数；分别以A（酶解时间）、B（pH）、C（酶添加量）、D（酶解温度）作为自变量，每个自变量水平分别以-2、-1、0、1、2进行编码；试验因素编码及水平见表1。以DE值（Y）作为响应值，设计4因素5水平的糖化响应面试验，建立回归方程以确定最优糖化工艺条件。

表1　中心组合设计因素与水平Table 1 Factors and levels of central composite design

1.3.5测定方法

还原糖测定：斐林试剂滴定法［16］。

可溶性固形物：手持式折射仪测量［17］。

2　结果与分析

2.1野葛液化液的制备

采用1.3.3所述条件，α-淀粉酶液化后，DE值达到（19.16± 0.38）%。试验结果表明，该液化条件达到进一步糖化要求。液化后的DE值处于15%～20%较合适，液化液DE值过高，不利于糖化酶与底物形成络合结构，降低糖化效率；而DE值过低，液化后产物凝聚性强，易于重新结合，也不利于后续糖化［19］。

2.2单因素试验结果与分析

2.2.1酶解时间对DE值的影响

由图1可知，随着酶解时间的延长，糖化液DE值逐渐增大，180 min后，DE值增加缓慢并趋于稳定。与在糖化初阶段，糖化酶作用于α-1，4糖苷键或α-1，6糖苷键将糊精、低聚糖等衍生物水解为单糖，DE值增加明显。随着酶促催化反应的进行，产物的抑制作用以及产物间的重新聚合使得DE值在180 min后趋于稳定［20］。因此，选择酶解时间为180 min。

图1　酶解时间对糖化液DE值的影响Fig.1 Effect of enzymolysis time on DE value of saccharified solution

2.2.2pH对DE值的影响

由图2可知，糖化液pH从3.0增加到4.5时，其DE值逐渐提高，在pH达到4.5时达到峰值（72.89±0.11）%，继续增加糖化液pH，DE值反而降低。pH会影响酶活性基团的解离状态和酶活性中心的构象，从而影响酶与底物的结合力和催化能力［21］。水解环境酸或碱性过强均会影响酶的活力，使酶作用下降，DE值减少。因此，选择糖化液的最适pH值为4.5。

图2　pH对糖化液DE值的影响Fig.2 Effect of pH on DE value of saccharified solution

2.2.3酶添加量对DE值的影响

由图3可知，糖化酶添加量＜432 U/g时，糖化液DE值随酶添加量的增加呈现出逐渐增大的趋势；继续增大酶添加量，未观察到DE值有显著的增加。该酶添加量与紫甘薯、木薯的糖化酶添加量相比偏大，可能和野葛淀粉的结构与组成异于其他类型淀粉有关［22-24］，同时酶和底物可能存在着适当的比例，增大酶添加量并未使得DE值显著提高［15］。此外，酶添加量过大也造成酶的浪费。因此，选用酶添加量为432 U/g。

图3　酶添加量对糖化液DE值的影响Fig.3 Effect of glucoamylase addition on DE value of saccharified solution

2.2.4酶解温度对DE值的影响

由图4可知，酶解温度从40℃逐步提高至60℃，酶解速率显著增加；在酶解温度为60℃时，糖化液DE值达到峰值；继续提高酶解温度，DE值下降明显。40～60℃时，温度升高增加了单位时间内酶分子与底物的有效碰撞次数，反应速率增加，DE值提高。而酶解温度过高则改变了糖化酶的催化活性，致使酶解作用减弱［21］。因此，选择最佳酶解温度为60℃。

图4　酶解温度对糖化液DE值的影响Fig.4 Effect of temperature on DE value of saccharified solution

2.3响应面法优化试验结果与分析

2.3.1中心组合设计方案及结果分析

以酶解时间（A）、pH（B）、酶添加量（C）、酶解温度（D）为自变量，以DE值（Y）为响应值，运用中心组合设计进行响应面试验，共30组，试验方案及结果见表2。

表2　中心组合设计方案及结果Table 2 Scheme and results of central composite design

2.3.2回归模型拟合及方差分析

对所有试验数据（表2）经Design Expert 8.0.5b软件进行回归拟合，得回归方程：

Y=78.78+0.56A-0.15B+0.25C+0.30D-0.25AB-0.077AC-0.085AD+0.046BC+0.085BD-0.23CD-0.095A2-0.55B2+0.059C2-0.48D2。

该模型的方差分析见表3，回归模型高度显著（P＜0.000 1），失拟项不显著（P＞0.05），方程不失拟，模型在回归区域内拟合较好。决定系数R2=0.894 0，表明该模型相关性良好。离散系数（coefficient of variance，CV）越大，试验结果的可靠性和精确度越低，本试验CV=0.60%，结果可靠。该回归模型中精确度为10.068（＞4），数值可靠，模型可用于回归分析。

各因素对野葛糖化液DE值的影响顺序为：A（酶解时间）＞D（酶解温度）＞C（酶添加量）＞B（pH）；从回归方程系数显著性检验可知，一次项A（酶解时间）、D（酶解温度）以及二次项B2、D2表现为极显著（P＜0.01），一次项C（酶添加量）和交互项AB表现为显著（0.01＜P＜0.05）；交互作用中只有酶解时间和pH表现为显著，余下的交互项作用并不显著。

表3　回归模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression equation

2.3.3因素的交互作用对野葛糖化液DE值的影响

交互作用对响应值的影响可以通过等高线图和响应面图直观的反映出来，等高线图的形状反映交互作用的强弱。响应面图与等高线图相对应，椭圆表示交互作用显著，而圆形则表示交互作用不显著。

由图5可知，等高线沿pH轴向变化相对密集，pH对糖化液DE值的影响比酶解时间大，酶解时间和pH相互作用显著。在一定范围内，DE值随着酶解时间和pH的增大而增大；呈现先升高后降低的趋势。等高线分别沿pH和酶解温度轴变化的密集程度大致一致，pH和酶解温度对DE值的影响程度相近，相互作用不显著。当pH、酶解温度均较低时，DE值较低；随着pH和酶解温度的升高，糖化液DE值先缓慢升高，达到最大值后逐渐下降。等高线沿温度轴变化相对密集，说明酶解温度对DE值的影响比酶解时间大。在一定范围内，DE值随着酶解时间和温度增大而增大；随着酶解时间和温度的增大，DE值呈先升高后降低的趋势。

图5　酶解时间、pH及温度交互作用对糖化液DE值影响的响应曲面和等高线Fig.5 Response surface plots and contour line of effects ofinteraction between enzymolysis time，pH andtemperature on DE value of saccharified solution

2.4验证试验

对二次回归模型进行响应面分析，确定最佳工艺参数为：酶解时间220 min，pH 4.23，酶添加量528 U/g，酶解温度58.04℃；在此条件下的预测糖化液DE值为80.17%。根据试验的可操作性，将糖化的工艺参数调整为：酶解时间220 min，pH 4.2，酶添加量528 U/g，酶解温度58℃。此条件下重复试验3次，糖化液的DE实测平均值为（79.93± 0.20）%，与预测值接近，说明采用此响应面优化模型得到的工艺参数可靠。

3　结论

本试验对野葛的糖化工艺进行了研究，考察不同因素对野葛糖化的影响。采用中心组合设计进行响应面分析得到各因素对野葛糖化的影响大小依次为：酶解时间、温度、酶添加量、pH，最佳糖化条件为：酶解时间220 min，pH 4.2，酶添加量528 U/g，酶解温度58℃。在此条件下，酶解得到的糖化液DE值达到（79.90±0.20）%，与预测值80.17%接近。该模型能较好的预测野葛糖化条件与DE值的关系，证明中心组合设计优化野葛糖化工艺的可行性，为功能性保健酒的后续发酵及野葛的相关开发奠定基础。

［1］李明臣，李贵海.中药葛根地上部分的研究进展［J］.中国药房，2005，16（15）：1197-1199.

［2］郑皓，赵冉.不同品种葛根产地及化学成分分析研究［J］.中医药管理杂志，2006，14（4）：51-53.

［3］黄群，肖文军，孙术国，等.α-淀粉酶和糖化酶协同酶解葛根淀粉动力学研究［J］.食品科学，2012，33（21）：187-191.

［4］刘云，张瑶，和润喜.葛根及葛根食品的研究与开发现状［J］.中国林副特产，2010（1）：94-97.

［5］孔庆新，李思阳.葛根保健酒中葛根素的鉴别和含量测定［J］.食品工业，2014（12）：284-286.

［6］张鹏斐，吴卫国，傅冬和，等.葛根酒的开发［J］.食品与发酵工业，2012，38（2）：117-121.

［7］沈娜，李亦蔚，汪霞丽，等.葛根淀粉性质及改性方法研究进展［J］.食品与机械，2012，28（4）：245-249.

［8］XU H N，ZHANG Y X，HE C H.Ultrasonically assisted extraction of isoflavones from stem ofPueraria lobata（Willd.）Ohwi and its mathematical model［J］.Chinese J Chem Eng，2007，15（6）：861-867.

［9］XU H N，HUANG W N，HE C H.Modeling for extraction of isoflavones from stem ofPueraria lobata（Willd.）Ohwi using n-butanol/water twophase solvent system［J］.Sep Purif Technol，2008，62（3）：590-595.

［10］李艳华，梁金钟，范洪臣.响应面法优化γ-聚谷氨酸发酵培养基的研究［J］.食品科技，2008，33（3）：45-48.

［11］LI H，QIU T，GAO D，et al.Medium optimization for production of gamma-aminobutyric acid byLactobacillus brevisNCL912［J］.Amino Acids，2010，38（5）：1439-1445.

［12］MURALIDHAR R V，CHIRUMAMILA R R，MARCHANT R，et al.A response surface approach for the comparison of lipase production by Candida cylindraceausing two different carbon sources［J］.Biochem Eng J，2001，9（1）：17-23.

［13］YUAN L，LI Y，WANG Y，et al.Optimization of critical medium components using response surface methodology for phenazine-1-carboxylic acid production byPseudomonassp.M-18Q［J］.J Biosci Bioeng，2008，105（3）：232-237.

［14］孙鹏，裴国亮，孙先锋.中心组合设计优化酶法提取胖大海多糖工艺［J］.食品工业科技，2013，34（2）：269-272.

［15］戴缘缘，潘丽军，姜绍通，等.中心组合设计优化芋头浆糖化工艺［J］.食品科学，2015，36（6）：86-90.

［16］中华人民共和国国家质量监督检验检疫局，中国国家标准化管理委员会.GB/T 15038—2006葡萄酒、果酒通用分析方法［S］.北京：中国标准出版社，2006.

［17］中华人民共和国国家质量监督检验检疫局，中国国家标准化管理委员会.GB/T 12143—2008饮料通用分析方法［S］.北京：中国标准出版社，2008.

［18］中华人民共和国国家质量监督检验检疫局，中国国家标准化管理委员会.GB/T 20885—2007葡萄糖浆［S］.北京：中国标准出版社，2007.［19］程建军.淀粉工艺学［M］.北京：科学出版社，2011：119.

［20］易翠平，姚惠源.高纯度大米蛋白和淀粉的分离提取［J］.食品与机械，2005（6）：18-21.

［21］李兴革，李志江，牛广财，等.利用糖化酶水解马铃薯淀粉生产糖浆的工艺研究［J］.中国酿造，2010，29（6）：59-62.

［22］杨雅利，阚建全，沈海亮，等.紫甘薯酒发酵工艺条件的优化［J］.食品科学，2012，34（3）：157-162.

［23］陈俊英，刘永丽，黄会杰，等.木薯粉乙醇清液发酵中糖化条件的研究［J］.江苏农业科学，2015，43（7）：272-275.

［24］XIA Y，GAO W，JIANG Q，et al.Physicochemical，crystalline，and thermal properties of native and enzyme hydrolyzedPueraria lobata（Willd.）Ohwi and Pueraria thomsoniiBenth.starches［J］.Starch-Stärke，2012，64（11）：864-873.

Optimization of saccharification conditions ofPueraria lobata（Willd.）Ohwi with central composite design

CHU Chong1，YAO Shangjie1，HUANG Jun1，WU Chongde1，ZHOU Rongqing1，2*
（1.College of Light Industry，Textile&Food，Sichuan University，Chengdu 610065，China；2.National Engineering Laboratory for Clean Technology of Leather Production，Chengdu 610065，China）

UsingPueraria lobata（Willd.）Ohwi as raw material，the saccharification process was optimized by single-factor experiment，and based on this，the optimal sacchari fication conditions and quadratic regression equation were established by central composite design.The optimal saccharification conditions were obtained as follows：enzymolysis time 220 min，pH 4.2，glucoamylase addition 528 U/g，temperature 58℃.Under the conditions，the DE value of saccharification mash could achieve（79.93±0.20）%.

Pueraria lobata（Willd.）Ohwi；saccharification；dextrose equivalent value；central composite design

TS218

0254-5071（2016）09-0145-05doi：10.11882/j.issn.0254-5071.2016.09.033

2016-06-14

褚冲（1991-），男，硕士研究生，研究方向为现代发酵技术。

周荣清（1960-），男，教授，博士，研究方向为现代发酵技术和酶工程及其应用。