在线二维柱切换—超高效液相色谱法同时测定明目地黄丸中莫诺苷、马钱苷、芍药苷、丹皮酚的含量

刘永利 王常顺 王晓蕾 杨抒楠 刘兴国 冯丽

摘要：建立了二维柱切换超高效液相色谱法同时测定明目地黄丸中莫诺苷、马钱苷、芍药苷、丹皮酚含量的方法。一维色谱柱为Thermo Accucore XL C18（250 mm × 2.1 mm， 4 μm），二维色谱柱为DIONEX Acclaim phenyl1（150 mm × 4.6 mm， 3 μm），一维分析流动相为乙腈水，梯度洗脱，二维分析流动相为乙腈水，等度洗脱，14.5 min进行阀切换；检测波长：0～14.5 min为240 nm，14.5～30 min为275 nm，流速： 0.5 mL/min，柱温： 30℃。30 min即可完成明目地黄丸中莫诺苷、马钱苷、芍药苷、丹皮酚的含量测定，并有效地将莫诺苷同分异构体分离。莫诺苷、马钱苷、芍药苷、丹皮酚的线性范围分别为7.6～377 mg/L， 9.2～459 mg/L， 8.4～419 mg/L和8.2～409 mg/L，相关系数为0.9999，加样回收率为98.3%～100.2%。本方法快捷高效，可对控制明目地黄丸质量提供参考。

关键词 ：在线二维柱切换超高效液相色谱法； 明目地黄丸； 莫诺苷； 马钱苷； 芍药苷； 丹皮酚； 同分异构体

1 引 言

明目地黄丸由熟地黄、酒萸肉、牡丹皮、枸杞子、当归、白芍、山药、茯苓、泽泻、菊花、蒺藜、煅石决明等12味药组成，具有滋肾、养肝、明目之功效。方中熟地黄滋补肾阴，填精益髓，为君药，约占处方比例的18%，山药、酒萸肉、煅石决明各占处方的9%，其余8味分别占处方的7%，由于各味药成分复杂，其质量较难控制。《中国药典》2015年版一部分别采用了3种色谱系统测定酒萸肉、白芍、牡丹皮三味药材中所含主要活性成分[1～3]马钱苷、芍药苷和丹皮酚等3种成分的含量，操作费时。由于马钱苷与丹皮酚等成分极性相差较大，文献报道也多采用不同色谱系统进行分离测定[4～6]。莫诺苷（C17H26O11）是一种环烯醚萜苷化合物，为酒萸肉的主要活性成分，对缺血性脑损伤具有保护和修复作用，对神经细胞保护作用较强，根据7位的羟基朝向不同，有7α和7β 兩种异构体（图1），文献对其分析方法研究较少[7，8]。近年来，二维液相色谱技术广泛应用于复杂体系的分离[9，10]，大大提高了分离效率，本实验根据测定成分的分子结构特点，采用在线二维柱切换技术，使用了两种不同类型的色谱柱，同时对莫诺苷、马钱苷、芍药苷和丹皮酚进行分析测定，还将莫诺苷两种异构体进行了分离，为更好地控制明目地黄丸的质量，研究其物质基础提供了参考依据。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

Ultimate 3000超高效液相色谱仪， 配双三元梯度泵、带有一个十通阀的柱温箱、二极管阵列检测器；AE240电子天平（瑞士Mettler公司）；Integral 10 MilliQ超纯水仪（德国Millipore公司）。

对照品：莫诺苷（北京市药品检验所提供，批号：201304，含量以100%计），马钱苷（中国食品药品检定研究院提供，批号：111640200503），芍药苷（中国食品药品检定研究院提供，批号：110736201438，含量以96.4%计），丹皮酚（中国食品药品检定研究院提供，批号：110708200505）。

试剂：乙腈为色谱纯；水为超纯水；其它试剂均为分析纯。

2.2 溶液的配制

2.2.1 对照品溶液的配制

准确称取莫诺苷9.44 mg、马钱苷11.48 mg、芍药苷10.87 mg、丹皮酚10.24 mg，置25 mL容量瓶中，加50%甲醇溶解并定容，作为对照品贮备液。

2.2.2 供试品溶液的配制

取本品水蜜丸适量（浙江某药业，批号：110305），研细（过4号筛），准确称取0.7 g，置具塞锥形瓶中，加入50%甲醇25 mL，密塞，摇匀，称定重量，超声处理30 min，放置至室温，再称定重量，用50%甲醇补足减失的重量，摇匀，经滤膜过滤，待测。

2.3 色谱条件

一维色谱柱为Thermo Accucore XL C18（250 mm×2.1 mm，4 μm），左泵：乙腈为流动相A，水为流动相B，梯度洗脱： 0～5 min，6%A；5～12 min， 6%～10% A；12～15 min， 10%～70% A；15～20 min，70% A；20～26 min，70%～90% A。二维色谱柱为DIONEX Acclaim phenyl1（150 mm×4.6 mm，3 μm），右泵：流动相：乙腈水（30∶70， V/V）等度洗脱；柱温：30℃；检测波长： 0～14.5 min，240 nm；14.5～30 min，275 nm；流速： 0.5 mL/min；阀切换时间：0 min，1→2； 14.5 min，1→10； 26 min，1→2。进样量： 2 μL。系统连接见图2。

3 结果与讨论

3.1 色谱柱的选择

莫诺苷、马钱苷、芍药苷、丹皮酚极性相差较大，而且明目地黄丸成分复杂，在一根色谱柱上对4种组分进行分离，保留时间长，芍药苷、丹皮酚与杂质峰分离度差，峰形拖尾严重。本研究采用二维色谱柱进行分离，考察了3种不同类型的C18色谱柱，在Accucore XL C18色谱柱上，目标峰与杂质峰分离较好，Accucore XL C18色谱柱是基于Core Enhanced TechnologyTM （表面多孔增强核技术）结合相键合与柱填充技术的新一代色谱柱，对非极性分析物具有强保留，还很好地区分了莫诺苷的两种同分异构体。在Accucore XL C18色谱柱上，丹皮酚有较多杂质峰干扰，遂采用阀切换将其转移到二维的苯基柱上进行分离。苯基柱对于含有苯环和共轭结构的丹皮酚的分离非常适合，与干扰峰得到很好的分离（图3）。

3.2 流动相及阀切换的选择

分别选择乙腈0.1%磷酸、乙腈水与甲醇水等流动相系统，结果表明，乙腈水各目标化合物峰形好，基线平稳。借助Ultimate 3000双三元的阀切换技术，采用两种不同类型的色谱柱，莫诺苷、马钱苷、芍药苷在一维色谱进行分离，在芍药苷出峰后，即切换到二维色谱上对丹皮酚进行分离，最终达到好的分离度与较高的柱效。

3.3 检测波长的选择

分别称取莫诺苷、马钱苷、芍药苷、丹皮酚对照品适量，用50%甲醇配制成适宜浓度的对照品溶液，在200～400 nm进行光谱扫描。结果表明，莫诺苷＼，马钱苷、芍药苷和丹皮酚的最大吸收峰分别位于240， 237， 230和275 nm处。在确保准确测定的基础上，选择240 nm作为莫诺苷、马钱苷、芍药苷的测定波长，275 nm作为丹皮酚的测定波长。

3.4 方法学考察

3.4.1 标准曲线的制备

分别准确移取2.2.1节制备的对照品储备液适量，加50%甲醇稀释成5个不同浓度的混合对照品溶液，进样测定，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归，结果见表1。

3.4.2 精密度实验

取线性中间点混合对照品溶液，连续进样6次，记录峰面积，结果表明，莫诺苷、马钱苷、芍药苷、丹皮酚峰面积RSD分别为0.6%， 0.5%， 0.8%. 0.7%，表明仪器精密度良好。

3.4.3 重复性实验

取同一批样品（批号：20130713），研细，分别准确称取0.35， 0.70和1.05 g各3份，按2.2.2节方法制备供试品溶液，进样测定。莫诺苷、马钱苷、芍药苷、丹皮酚含量分别为0.672， 0.521， 1.376和0.464 mg/g，RSD分别为0.6%， 0.2%， 0.2%和0.3%，表明本方法重复性良好。

3.4.4 回收率实验

取已知含量的样品（批号：20130713），研细，精密称取9份，每份约0.35 g，每3份为一组，分别精密加入用50%甲醇溶液配制的低、中、高三個浓度的混合对照品溶液25 mL，按2.2.2节项下方法制备供试品溶液，进样测定，计算回收率。结果莫诺苷、马钱苷、芍药苷、丹皮酚回收率分别为98.37%， 99.50%， 100.24%和100.22%，RSD分别为0.80%， 0.70%， 0.53%和0.96%。结果表明，本方法回收率良好。

3.4.5 稳定性实验

取同一份供试品溶液，分别在0， 1， 3， 5， 9和24 h进样测定，结果莫诺苷、马钱苷、芍药苷、丹皮酚峰面积RSD分别为1.07%， 1.47%， 0.81%和0.28%，表明供试品溶液至少可稳定24 h。

3.5 样品测定结果

取不同企业样品10批，按2.2.2节制备供试品溶液，在2.3节色谱条件下测定，结果见表2。各企业样品含量差距较大，可能是由于药材产地、采收期等原因造成。

分析结果表明，本方法有效地减少了明目地黄丸中杂质对目标化合物的干扰，提高了样品检测效率，具有较普遍的适用性。

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Abstract An online Twodimensional column switching ultra performance liquid chromatography （2DUPLC） method was established for simultaneous quantification of morroniside， loganin， peoniflorin， paeonol in Mingmudihuang Pill. The firstdimensional column was Thermo Accucore XL C18 （250 mm ×2.1 mm， 4 μm） while the seconddimensional column was DIONEX Acclaim phenyl1 （150 mm×4.6 mm， 3 μm）. Acetonitrile and water were used as mobile phase with a gradient elution in the firstdimensional analysis and the seconddimensional analysis used acetonitrilewater as mobile phase with a isocratic elution. The valve switching time was 14.5 min， the detection wavelength was set at 240 nm in 0-14.5 min and 275 nm in 14.5-30 min. The flow rate was 0.5 mL/min， and the column temperature was 30℃. The determination of four compounds in Mingmudihuang Pill was completed in 30 min and it could effectually segregate the isomer of morroniside. The linear ranges of morroniside， loganin， peoniflorin and paeonol were 7.6-377 mg/L， 9.2-459 mg/L， 8.4-419 mg/L and 8.2-409 mg/L， respectively， and all the correlation coefficients （r） were>0.9999. The recoveries of the four compounds were 98.3%-100.2%. It was proved that this method could greatly improve the sufficiency of sample analysis and could control the quality of Mingmudihaung Pill efficiently.

Keywords Online twodimensional column switching ultra performance liquid chromatography； Mingmudihuang pill； Morroniside； Loganin； Peoniflorin； Paeonol； Isomer