超声萃取—高效液相色谱—串联质谱法测定大气颗粒物中甾醇类化合物

赵起越 赵红帅 刘保献 王焱 骆昉

摘要：采用超声萃取与液相色谱串联质谱联用，建立了快速测定大气颗粒物中甾醇类化合物的方法。甾醇类化合物用甲醇超声萃取，浓缩后使用液相色谱串联质谱分析。采用Waters公司Atlantis C18色谱柱（100 mm × 2.1 mm，3 μm）， 以乙腈和水混合流动相梯度洗脱，实现了胆甾醇、豆甾醇、菜油甾醇及β谷甾醇的分离。并在APCIMS/MS MRM模式下定量检测。在选取的实验条件下，方法回收率在80.3%97.7%之间，检出限0.015 ng/m3，相对标准偏差小于15%，日内及日间测定精密度小于20%。本方法具有较好的准确性及精密度，实际样品的测试结果表明， 方法可以满足大气颗粒物中甾醇类化合物的定量分析要求。

关键词 ：超声萃取；高效液相色谱串联质谱；大气颗粒物；甾醇

1 引 言

甾醇是一类具有生物活性的物质，广泛存在于自然界中，与动植物的新陈代谢密切相关[1，2]。大气颗粒物中的甾醇类化合物主要包括胆甾醇、菜油甾醇、豆甾醇及β谷甾醇等。有关研究表明：胆甾醇可以作为城市大气中烤肉等烹饪源的示踪化合物，而β谷甾醇可作为生物质燃烧的有机示踪化合物[3，4]，因此大气颗粒物中甾醇类化合物的分析测定对颗粒物源解析工作非常重要。

甾醇的分析方法很多，主要有化学分析法、薄层色谱法、气相色谱分析法及液相色谱分析法等。化学分析法（包括毛地黄皂甙法及酶法）只能测定甾醇的总量，薄层色谱法灵敏度和重现性较差，气相色谱直接进样法进样口温度过高，易造成目标化合物的分解，液相色谱与紫外（Ultraviolet，UV）及蒸发光散射检测器联用法选择性差，灵敏度较低[5，6]。

气相色谱质谱联用分析方法（Gas chromatographymass spectrometry， GC/MS）是常用的甾醇类化合物标准分析方法[7，8]，该方法使用衍生化试剂与样品进行衍生反应，应用质谱检测器（MS）进行测定。方法流程长，试剂毒性大，检测成本高，分析时间长。液相色谱质谱联用方法无需衍生，检测快速、准确，是进行甾醇类物质含量测定的有效方法，食品、动物体中甾醇类化合物的液相色谱串联质谱检测工作已经开展[9，10]，但使用该方法进行大气颗粒物中甾醇类化合物的分析尚无文献报道。在前人工作基础上，本研究采用超声萃取与液相色谱串联质谱联用，建立了测定大气颗粒物中4种甾醇类化合物的方法。测量精密度小于20%。相比气相色谱质谱联用分析甾醇类化合物的方法，本方法更加快速、经济，灵敏，为大气颗粒物中甾醇类化合物的分析提供了较好的技术支持。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

Waters Alliance 2695高效液相色谱仪、Quattro Premier XE 三重四极杆质谱仪（美国Waters公司）；TDZ5WS多管架自动平衡离心机（湘仪离心机厂）；氮气蒸发仪（NEVAPTM111，美国 Organomation Associates公司）

甲醇、二氯甲烷、正己烷和乙腈（色谱纯，美国J T Baker公司），娃哈哈纯净水（市售），植物甾醇标准品胆甾醇、菜油甾醇、豆甾醇、β谷甾醇（百灵威化学技术有限公司）。

2.2 样品来源

2012年及2013年在北京市部分地区使用大流量采样器采集大气颗粒物样品，滤膜为玻璃纤维及石英材质，采样流速1.13 m3 /min，采样时间24 h，滤膜面积50.24 cm2。为了去除干扰，滤膜在采样前，在马弗炉中550℃加热6 h以上，空白滤膜经实验测定不含有目标化合物。

2.3 标准溶液的配制

取胆甾醇、菜油甾醇、豆甾醇及β谷甾醇固体，配成浓度为1000 μg/mL的甲醇储备液，再逐级稀释成0.01，0.05，0.1， 0.2， 0.5， 1.0， 2.0， 5.0和10 μg/mL的混合标准溶液。

2.4 样品前处理

截取6.1544 cm2带有颗粒物样品的滤膜加入5 mL甲醇超声萃取两次，离心分离后，在氮气环境中浓缩至1 mL， 经0.22 μm滤膜过滤，进行仪器分析。

2.5 色谱及质谱条件

Atlantis C18色谱柱（100 mm×2.1 mm，3 μm，Waters公司），流动相：乙腈（A）和水（B），梯度洗脱程序为，0～10 min，90%B；10～11 min，90%～100%B；11～12 min，100%～90%B。柱温40℃，流速0.8 mL/min，进样体积：50.0 μL。使用大氣压化学离子源（Atmospheric pressure chemical ionization，APCI），正离子扫描，多反应监测（Multiple reaction monitoring，MRM）模式；电晕电流：2.0 μA；离子源温度：120℃；脱溶剂温度：500℃；脱溶剂气流量：600 L/h；锥孔气流量：50 L/h。在样品测试前，使用调谐液校正质量轴。

2.6 样品测定

用针泵直接进样，确定了4种甾醇的质谱分析参数，列于表1。

3 结果与讨论

3.1 萃取条件的选择

3.1.1 萃取溶剂的选择 考察甲醇、正己烷、二氯甲烷、正己烷二氯甲烷（1∶2， V/V）及甲醇与二氯甲烷不同比例混合溶剂（3∶2， 2∶1， 4∶1， V/V）对颗粒物样品的萃取效果，结果见图1。甲醇、二氯甲烷、正己烷等溶剂均可萃取颗粒物样品中甾醇，但甲醇对4种甾醇萃取效率较高，另外，甲醇与流动相互溶性很好，故选取甲醇做萃取溶剂。

3.1.2 萃取溶剂体积的选择

用特制裁刀截取6.1544 cm2的带颗粒物样品的滤膜，比较加入萃取溶液体积为5 mL， 6 mL， 8 mL， 10 mL及12 mL的萃取情况。结果表明， 随着萃取溶剂量的增加，目标化合物萃取量有所增加，但体积加大，目标化合物浓度会降低，浓度过低必须经过浓缩才能测定，且溶液体积增加浓缩损失加大。综合各种因素，发现5 mL溶剂可以较完全地萃取颗粒物中的4种甾醇类化合物，同时样品经浓缩后的浓度在定量分析范围之内，因此选取萃取溶剂体积5 mL进行实验。

3.1.3 超声萃取次数及时间 实验考察了超声10， 20及30 min的萃取效果，比较了1次和2次、3次超声的效率，发现随着超声时间的延长及次数的增加，萃取量增大。但超声时间从20 min延长至30 min时，萃取量增加很少，而花费时间较多。超声3次比2次萃取量大一些，但转移、浓缩的损失也增加，因此选择超声2次、每次20 min萃取（见图2及图3），回收率实验表明这种萃取可以满足颗粒物中甾醇类化合物的分析要求（表3）。

3.2 色谱条件的选择

3.2.1 色谱柱的选取

甾醇类化合物分子极性较弱，可以选取反相色谱柱进行分离。本研究比较了6种C18柱（Symmetry C18 ， Agilent Eclipse XDBC18， XTerra C18， Xbridge C18， Atlantis C18和Hypersil ODS柱）及1种C8柱（XTerra C8）对4种植物甾醇的分离情况。结果表明， 大多数色谱柱可以分离胆甾醇及β谷甾醇，不能分开菜油甾醇及豆甾醇。有文献报道在使用乙腈/异丙醇做流动相时，Waters Symmetry C18色谱柱近1 h可分开上述两种化合物，但考虑异丙醇粘度较大，不适于做质谱分析[11]。本实验采用Atlantis C18色谱柱， 在乙腈、水做流动相时， 对4种甾醇类化合物实现了较好的分离，尤其是菜油甾醇及豆甾醇的分离度较大，同时灵敏度也较高，优于前期报道[9，11～15]。

3.2.3 色谱柱柱温对分离的影响

柱温是影响分离度及柱效的主要原因之一，温度升高，溶质和溶剂分子扩散加快，且流动相的传质阻力减小，化合物容量因子变小。考察了柱温25℃， 30℃， 35℃， 40℃， 45℃及50℃时4种甾醇的分离情况。4种甾醇化合物的容量因子随柱温变化如图5所示。柱温过高会损坏色谱柱填料，缩短柱子使用寿命。在同等分离效果下，综合对色谱柱性能的保护和柱效的考虑，选择40℃作为4种甾醇的分析的色谱条件。在此温度下，甾醇化合物分离较好，灵敏度较高，且分析时间适当（15 min内完成分析）。

3.2.4 流速的选取

流速的选择综合了目标化合物的分离、检测灵敏度及色谱峰的保留时间来确定。本研究进行了几种流速（0.3， 0.5， 0.7和0.8 mL/min）的对比实验，发现在较低的流速（如0.3 mL/min）下4种甾醇的保留时间较长，灵敏度较差。随着流速的提高，保留时间逐渐缩短，检测灵敏度提高。至流速达到0.8 mL/min时，难分离物质对分离度适当，灵敏度较好，保留时间也比较合适。综合考虑各种因素，选择0.8 mL/min的流速。

3.2.5 进样量的选取

分别选取5， 10， 15， 20， 30和50 μL样品进行分析，结果表明，色谱峰响应值会随着进样量增加而增加，为保证有较高的分析灵敏度，最终选取进样量50 μL。

3.3 质谱条件的选择

3.3.1 离子源及电离模式的选取

3.3.2 电晕电流强度的优化 质谱的电晕电流强度与检测灵敏度有一定关系，本研究进行了6种电流强度（1， 2， 3， 4， 5及6 μA）的实验，发现电晕电流为2.0 μA时， 4种甾醇的信号强度最高，3.0 μA时次之，其余的条件较低（图6），故选用2.0 μA进行实验。

3.3.3 脱溶剂气温度的优化 本研究考察了脱溶剂气温度400℃，500℃，600℃，800℃的分析效果，发现不同温度，实验结果接近，其中以500℃为最好，最终选取500℃为脱溶剂气温度。

3.3.4 脱溶剂气流速的优化

质谱的脱溶剂气流速对分析灵敏度有一定影响，本研究进行了6种气流流速（400， 500，600，700，800及1000 mL/min）的实验，发现脱溶剂气流速600 mL/min时信噪比最高，测定灵敏度最好，故选用该条件进行实验（图7）。

3.4 方法确证

3.4.1 标准曲线及检出限 取2.3节配制的甾醇混合标准溶液，以目标组分的响应值y对相应的质量浓度x（μg/mL）绘制标准曲线，并以10倍信噪比计算方法的定量限（LOQ），以3倍信噪比计算方法检测限（LOD）列于表2。在给定的浓度范围内，4种甾醇的线性关系良好，检出限与衍生气相色谱法相当[4]，可以满足大气顆粒物中甾醇类化合物的分析要求。

3.4.2 方法的准确度

向大气颗粒物样品中添加3个浓度水平的4种甾醇类化合物的混合标准溶液，制成低、中及高浓度的加标样品，按照上述方法进行前处理，每个浓度水平平行操作6次，计算回收率及相对标准偏差（RSD），结果列于表3。大气颗粒物中4种甾醇类化合物的3个浓度水平加标回收率均大于80%，6个平行样品的相对标准偏差小于15%，方法准确度符合有机分析要求。

3.4.3 方法的精密度 对两种不同含量的大气颗粒物样品日内连续测定6次，并进行3日内的重复测定，结果见表4。4种甾醇类化合物的日内重复测定标准偏差小于10%，3天的重复测定标准偏差小于20%，方法日内及日间测定精密度较好。

3.5 实际样品的测定

使用上述方法，对北京城区采集的大气颗粒物样品进行分析，结果见表5，分析谱图如图8。由表5可知，北京城区的大气颗粒物样品中可以检测到4种甾醇类化合物，本方法满足科学研究及监测管理需求。

4 结 论

本实验通过对色谱及质谱条件进行优化，并对大气颗粒物样品前处理方法进行筛选，建立了大气颗粒物中4种甾醇类化合物的液相色谱串联质谱分析方法。本方法不需衍生反应，操作简单，分析快速，4种甾醇类化合物的加标回收率大于80%，相对标准偏差小于15%，方法检测限能够满足大气颗粒物中甾醇类物质检测分析的要求，适于大量样品的分析监测。使用液相色谱串联质谱分析大气颗粒物中的甾醇类化合物，拓展了环境中该类物质分析的新思路，对后续的监测管理工作提供了技术支持。

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Abstract A rapid analytical method was developed for the determination of 4 sterols in atmospheric particles by ultrasonic extraction coupled with high performance liquid chromatographytandem mass spectrometry （HPLCMS /MS）. After extraction by methanol and enrichment， sterols were separated on an Atlantis C18 column （100 mm×2.1 mm， 3 μm） with acetonitrile and water served as mobile phase in gradient elution， then determined by HPLCMS/MS using atmospheric pressure chemical positive ionization （APCI+） and multiple reaction monitoring （MRM）. Parameters of chromatography and mass spectrometry， as well as conditions of ultrasonic extraction were optimized. The developed method provided good linearity （R>0.99） and high recoveries （80.3%-97.7%） for 4 sterols. Low detection limits were obtained as 0.015 ng/m3， with RSD less than 15% （n=6）. Comparing with GC/MS， this method was more rapid， sensitive and economical because the derivation was eliminated from the procedure， thus saving a lot of resources. Samples of atmospheric particles were detected using this method， and the results indicated that this method could meet the requirements for quantitative analysis of sterols in atmosphere.

Keywords Ultrasonic extraction； High performance liquid chromatographytandem mass spectrometry； Atmospheric particles； Sterol