中性蛋白酶发酵液脱色工艺优化

桂丽，孙谧，刘均忠，王伟

1(中国水产科学研究院黄海水产研究所，农业部海洋渔业可持续发展重点实验室,青岛市海洋酶工程重点实验室,山东 青岛,266071)　2(上海海洋大学食品学院，上海, 201306)



中性蛋白酶发酵液脱色工艺优化

桂丽1,2，孙谧1*，刘均忠1，王伟1

1(中国水产科学研究院黄海水产研究所，农业部海洋渔业可持续发展重点实验室,青岛市海洋酶工程重点实验室,山东 青岛,266071)2(上海海洋大学食品学院，上海, 201306)

为了脱除中性蛋白酶发酵液中的色素，降低色素在产品应用中的影响，研究并比较了树脂、活性炭、H2O2对中性蛋白酶发酵液的脱色效果。实验结果表明，阴离子交换树脂D380(Cl)型能使其有效脱色并保留较高的蛋白酶活性；利用响应面实验建立数学模型，并确定D380(Cl)型树脂脱色最适流速为2.35柱体积/h(bedvolume/h,BV/h)，最佳上样量为0.4BV，最适上样酶活力为40 000U/mL，最适pH值为6，此时，中性蛋白酶发酵液脱色率为86%，酶活回收率为95%。D380(Cl)型树脂连续使用10次仍有较强脱色能力，脱色率在80%以上，酶活回收率在90%以上。

中性蛋白酶；脱色；树脂；响应面

中性蛋白酶是最早被应用于工业生产的蛋白酶类，由于其作用条件温和，催化速率较快，无工业污染，被广泛应用于食品、医药、洗涤、皮革、银洗、饲料、化工和废弃物处理[1]；特别是因为中性蛋白酶能水解原料蛋白且减少苦味肽的产生，其在食品工业上的应用更为广阔[2]。中性蛋白酶发酵液中含有大量色素杂质，应用在食品加工领域时这些杂质会直接影响产品的外观品质，此外，脱除色素对精制酶以提高酶的附加值也有重要意义。因此，针对中性蛋白酶发酵液建立有效的脱色方法成为提高其应用质量的迫切需求。由于不同蛋白酶的空间结构及理化性质存在差异，对不同种类的蛋白酶发酵液脱色需要筛选合适的脱色介质：王芳等利用阴离子交换树脂D352对低温碱性蛋白酶MP发酵液进行脱色，脱色率和酶活回收率均能达到90%以上[3]；JOO等人利用阴离子交换树脂HPA75对碱性蛋白酶BACP发酵液进行脱色，脱色率能达到80%以上，酶活几乎无损失[4]；但是，国内外专门针对中性蛋白酶发酵液进行脱色的研究不多。本文从适合工业化生产的要求出发，以南海海域分离的1株产中性蛋白酶菌株的发酵液为原料[5]，比较了不同脱色介质对中性蛋白酶发酵液的脱色效果，进而选取合适的脱色介质并优化脱色工艺条件，以期提高中性蛋白酶的应用品质。

1　材料与方法

1.1实验材料

中性蛋白酶发酵液：本课题组利用10L发酵罐发酵制备，pH7～8，经絮凝、过滤及硫酸铵沉淀除去培养基杂质和菌体，酶泥复溶得不同浓度中性蛋白酶发酵液。颗粒活性炭、粉末活性炭、30%H2O2购自国药集团化学试剂有限公司；大孔吸附树脂NKA、D3520，弱碱性阴离子交换树脂D380，弱酸性阳离子交换树脂110均购自南开大学化工厂；弱碱性阴离子交换树脂D316购自山东鲁抗立科，其他试剂均为国药分析纯。

1.2实验仪器

Φ26mm×457mm玻璃离子交换柱，北京欣维尔玻璃仪器有限公司；UV-2550紫外可见分光光度计，日本岛津公司；CR21GⅢ高速离心机，日立公司；LKB2219恒温水浴锅，瑞典BROMMA公司。

1.3活性炭脱色

选取初始酶活为10 000U/mL的中性蛋白酶发酵液适量，用0.1mol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液调节反应的pH值至5.0，添加10g/L的颗粒和粉末活性炭，50 ℃水浴振荡保温脱色1h，离心取上清为脱色样品，调pH至7.0，取样测定其吸光度与酶活。

1.4H2O2脱色

选取初始酶活为10 000U/mL的中性蛋白酶发酵液适量，用氨水调pH至8.0，加入30%H2O2，使H2O2终质量分数达到3%，50 ℃水浴保温脱色1h，调pH至7.0，取样测定其吸光度与酶活。

1.5树脂脱色

1.5.1树脂预处理[6]

大孔吸附树脂用体积分数为4%的HCl浸泡4h，用去离子水洗至中性后，再用40g/L的NaOH浸泡4h，去离子水洗至中性，体积分数为95%的乙醇浸泡5h，去离子水洗净，湿法装柱使用；阴离子交换树脂用4%HCl和40g/L的NaOH各浸泡4h，去离子水洗至中性，4%HCl浸泡3h转型洗至中性或直接湿法装柱使用；阳离子交换树脂用40g/L的NaOH和4%HCl各浸泡4h，去离子水洗至中性，40g/L的NaOH浸泡3h转型洗至中性或直接湿法装柱使用。

1.5.2树脂脱色筛选

取中性蛋白酶发酵液1/3BV，样品酶活力20 000U/mL，以1BV/h的流速上样，后用洗脱液以与上样流速相同的流速进行洗脱，收集液定容后取样测定其吸光度与酶活。

1.5.3树脂脱色条件优化

取1.5.2中筛选出的最优树脂，利用单因素实验分析高径比、流速、pH值、上样酶活力、上样量对脱色效果的影响。根据单因素实验结果进行响应面实验，根据中心组合实验设计原理，设计三因素五水平响应面实验，采用Design-Expert8.05软件对数据进行分析，建立数学模型，根据模型预测最佳脱色条件并进行验证[7]。

1.5.4树脂再生性能评价

取1.5.2中筛选的最优树脂，按最适条件进行脱色，脱色后用4%HCl和40g/L的NaOH各浸泡4h再生，去离子水洗至中性，4%HCl浸泡3h转型洗至中性，湿法装柱使用。树脂共再生9次。

1.6脱色效果分析方法

1.6.1脱色率的测定

将脱色前发酵液和脱色后发酵液稀释至同等倍数，以420nm[8]下吸光度为表征色值，按公式(1)计算脱色率：

(1)

式中：D，脱色率；A0，脱色前吸光度；A，脱色后吸光度。

1.6.2蛋白酶酶活的测定(Folin-酚法)

参考国家标准GB/T23527—2009进行，具体如下：1mL稀释后酶液与1mL质量分数为1%的酪素溶液混合，40 ℃水浴10min，2mL的0.4mol/L三氯乙酸(TCA)终止反应，静置过滤；空白对照加样顺序为酶液—TCA—酪素。取1mL上清液加5mL的0.4mol/LNa2CO3溶液、1mL福林试剂，置于40 ℃水浴中显色20min取出，冷水冷却至室温，680nm波长下比色。以每毫升原酶液在40 ℃、pH7.0条件下水解酪蛋白，每分钟释放1μg酪氨酸的酶量定义为1个酶活单位。

2　结果与讨论

2.1脱色效果比较

表1中列出了活性炭、H2O2和树脂的脱色效果，由该表可看出树脂脱色的方法明显优于活性炭和H2O2脱色：活性炭脱色和H2O2脱色会使酶活大幅度降低，这与脱色反应所处的较高温度、活性炭对蛋白的吸附作用以及H2O2的氧化作用有关，两种脱色方法的脱色率也较低，这与色素自身特性有关。根据表1中列出的结果，选择脱色率较高，酶活回收率相对较高的阴离子交换树脂D380(Cl)型进行下一步实验。

表1　三种不同脱色方法的比较

2.2阴离子交换树脂D380(Cl)型脱色工艺的研究

2.2.1单因素实验

处理条件对脱色效果的影响如图1～图5所示。

由图1可以看出，高径比越高越好，这符合塔板理论。高径比达到1∶6时，脱色率和酶活回收率增势趋于平缓。考虑实际实验操作因素，选择1∶6为后续实验所用高径比。

流速过高则色素与树脂接触不充分而使脱色率下降，流速过低则树脂会吸附过多的蛋白酶导致酶活回收率下降。由图2可以看出，流速在2BV/h以下时对酶活回收率和脱色率影响较小，在流速增至2BV/h时，脱色率降至84%，酶活回收率增至90%左右，继续增加流速，发现其对酶活回收率影响不大，但脱色率仍在持续降低。综合考虑两因素，选择2BV/h为最适流速。

图1　高径比对脱色效果的影响Fig.1　Effect of aspect ratio on decoloration and protease yeild(注：流速1 BV/h，水为洗脱液，上样量1/3 BV，上样酶活力20 000 U/mL)

图2　流速对脱色效果的影响Fig.2　Effect of flow rate on decoloration and protease yield(注：水为洗脱液，上样量1/3 BV，上样酶活力20 000 U/mL)

发酵液与洗脱液的pH值会影响溶液中的色素、蛋白与树脂中离子的交换解离，同时，pH值对蛋白酶稳定性也有很大影响，因此，选择该蛋白酶较稳定的pH5～9进行pH因素影响实验。由图3可以看出，随着pH值增高，脱色率略微降低，酶活回收率先增后减，偏中酸性时酶活回收率和脱色率较高，这与该中性蛋白酶等电点和蛋白酶自身稳定性以及色素自身特性有关。综合考虑两因素，选择酶活回收率最高、脱色率较高的pH6为最适脱色pH值。

图3　pH值对脱色效果的影响Fig.3　Effect of pH value on decoloration and protease yield(注：流速2 BV/h，上样量1/3 BV，样品酶活力20 000 U/mL)

由图4可以看出，随着样品酶活力的增加，脱色率先增后减，酶活回收率变化不大。上样酶活力较低时，洗脱液颜色太浅，实测数据接近于0，测得数据不在线性范围内，造成脱色率较低；样品酶活力增加，实测数据逐渐在线性关系的数值范围内，此时随着色素量增大，色素和树脂的结合逐渐达到饱和，洗脱下来的色素相应增多，使得脱色率逐渐降低；此外，溶液浓度增大，黏性也增大，分子运动阻力增加，不利于被吸附物质向吸附剂表面扩散，这也导致了脱色率的降低。综合考虑，选择40 000U/mL为最适上样酶活力。

图4　上样酶活力对脱色效果的影响Fig.4　Effect of the concentration of sample solution on decoloration and protease yield(注：流速2 BV/h，pH值为6，上样量1/3 BV)

由图5可以看出，随着上样量的增加，脱色率递减，酶活回收率先增后减。上样量的增加会增加树脂吸附的色素的量，当色素与树脂的结合逐渐达到饱和，树脂对色素的吸附作用下降，脱色率逐渐降低。酶活回收率先增后减，是因为树脂对蛋白的吸附先达到了饱和，蛋白与树脂结合能力下降，此时随着上样量增加，酶活回收率相应的增加；上样量继续增加，蛋白流经树脂所需时间更长，与树脂的接触更加充分，使得树脂之间的空隙残留的蛋白更多，从而造成酶活回收率的下降。综合考虑，选择0.5BV为最适上样量。

图5　上样量对脱色效果的影响Fig.5　Effect of the size of sample solution on decoloration and protease yield(注：流速2 BV/h，pH值为6，上样酶活力40 000 U/mL)

2.2.2响应面实验

综合以上实验结果，流速、上样量、上样酶活力3因素对脱色效果影响大。因此，固定脱色pH值为6、高径比为1∶6，以流速2BV/h、上样量0.5BV、上样酶活力40 000U/mL为中心条件进行以流速、上样量、上样酶活力为自变量，脱色率和酶活回收率为双响应值[9]的响应面条件优化，设计中心组合实验。实验设计、结果如表2、表3所示。

表2　实验因素水平及编码

表3　中心组合实验设计及结果

根据CentralComposite设计了20组实验，结果见表3。利用Design-Expert8.05软件对表3两响应值进行多元回归拟合，得到D380(Cl)型树脂对中性蛋白酶发酵液脱色率Y1和酶活回收率Y2的回归方程分别为：

Y1= 84.70-0.65 X1-0.98 X2-1.73 X3-0.2 X1X2-0.24 X1X3+0.18 X2X3-0.14 X12+0.54 X22-1.56 X32

Y2= 95.66+1.25 X1-0.19 X2+1.32 X3-0.44 X1X2+6.25×10-3X1X3-0.52 X2X3-0.8 X12-1.23 X22-1.88 X32

两模型的方差分析显示，实验所建立的两个二次项模型具有高度显著性(P1=0.0004<0.05，P2=0.0001<0.05)，失拟项均不显著，两模型的R2分别为0.9112和0.9920，表明模型拟合度较好，能较好地预测实验结果。

综合两响应模型进行软件分析，得出当流速为2.35BV/h，上样量为0.4BV，样品酶活力为39 741.04U/mL，其余条件不变时，脱色率和酶活回收率有最大响应，理论最大脱色率为86.0%，酶活回收率为95.3%。为检验模型预测的准确性，在流速2.35BV/h、上样量0.4BV、上样酶活力为40 000U/mL条件下进行验证实验，3组平行实验脱色率分别为：86.1%、86.3%、85.9%，酶活回收率分别为：95.5%、95.1%、95.9%，与预测值接近，表明该模型预测效果良好。通过优化，阴离子交换树脂D380(Cl)型对中性蛋白酶发酵液的脱色率由最初的(83.2±1.2)%提高至(86.1±0.2)%，酶活回收率由最初的(84.9±0.6)%提高至(95.5±0.4)%，这表明该条件是中性蛋白酶发酵液脱色的理想条件。

2.2.3树脂再生性能评价结果

王芳等利用阴离子交换树脂D352对低温碱性蛋白酶MP发酵液进行脱色，树脂重复使用6次后仍有较好的脱色效果，但脱色率呈现逐渐降低的趋势[3]；JOO等人利用阴离子交换树脂HPA75对碱性蛋白酶BACP发酵液进行脱色，树脂重复使用4次时，脱色率由最初的78%降低至72%，酶活回收率由几乎无损失降低至93%[4]。由图6可以看出，在重复使用过程中脱色率和酶活回收率均未呈现明显降低趋势，使用第10次时脱色率和酶活回收率分别为84.0%、94.1%，说明树脂再生对脱色效果影响小，再生后树脂仍有较好的脱色性能。D380(Cl)型树脂能重复使用多次，降低了生产成本，满足工业生产需求。

图6　重复使用次数对脱色效果的影响Fig.6　Effect of the using times of resin on decoloration and protease yield(注：流速2.35 BV/h，pH值6，上样量0.4 BV，上样酶活力40 000 U/mL)

3　结论

(1)通过比较不同脱色介质对中性蛋白酶发酵液的脱色效果，发现树脂脱色效果优于活性炭和H2O2，在所筛选的树脂中阴离子交换树脂D380(Cl)型脱色效果最优。

(2)通过单因素实验及响应面实验分析得出D380(Cl)型树脂对该中性蛋白酶发酵液脱色的最适条件是流速2.35BV/h，上样量0.4BV，上样酶活力40 000U/mL，pH值为6，在此条件下，脱色率能达到86%，酶活回收率能达到95%，脱色效果相较初始筛选条件时有显著的提高。

(3)D380(Cl)型树脂重复使用10次后脱色率与酶活回收率仍分别超过80%、90%，且未呈现明显的降低趋势，说明树脂再生对脱色效果影响小，再生后树脂仍有较好的脱色性能，相较其他同类型的研究有一定优势。D380(Cl)型树脂能重复使用多次，降低了生产成本，满足工业生产需求，有一定应用价值。

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Theoptimizationofdecolorizationmethodofneutralproteasefermentedbroth

GUILi1,2,SUNMi1*,LIUJun-zhong1,WANGWei1

1(KeyLaboratoryofSustainableDevelopmentofMarineFisheries,MinistryofAgriculture;QingdaoKeyLaboratoryofMarineEnzymeEngineering,YellowSeaFisheriesResearchInstitute,ChineseAcademyofFisherySciences,Qingdao266071,China)2(CollegeofFoodScience&Technology,ShanghaiOceanUniversity,Shanghai201306,China)

Toremovethepigmentsinneutralproteasefermentedbroth,asimplemethodforthedecolorationofneutralproteasefermentedbrothwasdevelopedthroughdifferentmedium.IronexchangeresinD380 (Cl)demonstratedthehighestdecolorationefficiencyandgoodproteaserecovery.Undertheoptimizeddynamicadsorptionconditionsthroughsinglefactormethodandresponsesurfacemethodology(pH6,uploadingandelutionflowrateof2.35BV/h, 0.4BVof40 000U/mLenzymesolution),theratiosofdecolorationandproteaseyieldforD380 (Cl)were86%and95%,respectively.UsedD380 (Cl)couldberegeneratedeasily,andtheregeneratedD380(Cl)wasaseffectiveasnotusedone.After10timesreusesofregeneratedD380(Cl),theratiosofdecolorationandproteaseyieldcouldalsoreach80%and90%,respectively.Itprovidesapotentialapproachforlarge-scaleproductionofneutralprotease.

neutralprotease;decoloration;resin;responsesurfacemethodology

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201608017

硕士研究生(孙谧研究员为通讯作者，E-mail:sunmi@ysfri.ac.cn)。

国家自然科学基金-联合基金项目 (U1406402-5)；国际科技合作与交流专项 (2014DFG30890)；国家实验室——鳌山科技计划(2015ASKJ02-06)

2016-03-08改回日期：2016-04-25